Diagnoza wstrząsu mózgu związanego ze sportem przy użyciu metabolitów moczu

Tło:

Sportowy wstrząs mózgu lub związane ze sportem łagodne urazowe uszkodzenie mózgu (mTBI) dotyka pacjentów w różnym wieku, rasy i płci. Jest to problem medyczny, który jeśli nie jest odpowiednio leczony, może mieć katastrofalne skutki dla pacjentów i ich rodzin. MTBI lub wstrząśnienie mózgu (terminologia używana zamiennie w niniejszym wniosku) była ostatnio gorącym tematem w mediach, a wśród prominentnych polityków i sportowców, których wyniki kariery zmieniły się po wstrząśnieniu mózgu. Według Canadian Institute for Health Information zajęcia sportowe i rekreacyjne były trzecią najczęstszą przyczyną przyjęć z powodu TBI w kanadyjskich szpitalach w latach 2003-2004. W Stanach Zjednoczonych Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom szacuje, że rocznie podczas zajęć sportowych i rekreacyjnych dochodzi do 1,6 do 3,8 miliona wstrząsów mózgu. W Calgary w 2013 roku na oddziałach ratunkowych przyjmowano około 10 000 pacjentów z urazami głowy, z których 80% zdiagnozowano jako mTBI, a zdecydowana większość z nich była związana ze sportem (dane niepublikowane).

Obecnie nie ma jednego „złotego standardu” oceny lub markera diagnostycznego, który obiektywnie określiłby, czy pacjent doznał wstrząsu mózgu podczas uprawiania sportu, a jeśli tak, to ile czasu zajmie powrót do zdrowia. Wstrząs mózgu jako taki pozostaje rozpoznaniem klinicznym opartym na objawach pourazowych, objawach fizycznych i upośledzeniu funkcji poznawczych, które w najlepszym przypadku przeprowadza wyszkolony i doświadczony personel medyczny. Jest to jednak przede wszystkim jakościowe, zindywidualizowane podejście do diagnozowania i zazwyczaj jest zaciemnione brakiem obiektywnych wyników klinicznych. Inne narzędzia diagnostyczne mogą pomóc klinicyście w diagnozowaniu wstrząśnienia mózgu, takie jak Sport Concussion Assessment Tool 3 (SCAT3) (Załącznik 1), ale niestety nie zostało to zweryfikowane i zostało opracowane w oparciu o konsensus ekspertów. Skomputeryzowane testy neuropsychologiczne mogą również pomóc w ocenie powrotu do zdrowia po wstrząsie mózgu; jest jednak kosztowna, czasochłonna i ostatnio była krytykowana za brak swoistości i wrażliwości na urazy głowy.

W ciągu ostatnich 20 lat naukowcy badali biomarkery, takie jak S100B i specyficzna dla neuronów enolaza, mając nadzieję na znalezienie ilościowego podejścia do diagnozowania i prognozowania wstrząsu mózgu. To niestety spotkało się z dużym rozczarowaniem, ponieważ żaden z tych markerów sam w sobie nie ma odpowiedniej specyficzności ani czułości, aby można go było stosować jako pojedynczy biomarker w praktyce klinicznej.

Metabolomika jest definiowana jako „ilościowy pomiar odpowiedzi metabolicznej żywych systemów na bodźce patofizjologiczne lub modyfikacje genetyczne” i opiera się na platformach analitycznych, takich jak spektroskopia protonowego rezonansu magnetycznego (1H NMR) i / lub spektrometria mas. Badania metaboliczne dostępnych klinicznie płynów biologicznych, takich jak krew i mocz, zapewniają skomplikowany i stosunkowo nieinwazyjny obraz tej odpowiedzi. Do tej pory wykazano, że metabolomika jest użytecznym narzędziem biomarkerowym w stwardnieniu zanikowym bocznym, chorobie Alzheimera, chorobie Parkinsona, noworodkowej encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej, raku mózgu, stwardnieniu rozsianym, starzeniu się i chorobach neurodegeneracyjnych, padaczce, udarze, ciężkim urazowym uszkodzeniu mózgu i pediatrycznych wstrząs septyczny. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą żadne badanie nie oceniało ilościowego profilowania metabolomicznego jako narzędzia diagnostycznego i prognostycznego w przypadku wstrząsu mózgu w sporcie.

To badanie pilotażowe pomogłoby w następujących kwestiach:

1. Aby określić wykonalność testowania metabolomiki w populacji sportowej z wstrząsem mózgu.
2. Pierwsze tego rodzaju badanie, w którym wykorzystano ilościowe profilowanie metaboliczne, aby pomóc w diagnozie ostrego sportowego wstrząsu mózgu.
3. Pierwsze tego rodzaju badanie mające na celu opracowanie metabolicznego „odcisku palca”, który może pomóc w przewidywaniu powrotu do zdrowia po ostrym sportowym wstrząsie mózgu.

Pacjenci zostaną poproszeni o dostarczenie próbki moczu ze środkowego strumienia między 7-9 rano przed urazem i po wstrząśnieniu mózgu. Porcje moczu będą pobierane natychmiast przez wirowanie, a następnie przechowywane w temperaturze -80°C do czasu, gdy będą potrzebne do analizy. Po zebraniu wszystkich próbek zostaną one podzielone na partie i przetransportowane do University of Lethbridge w celu analizy.

Żadne próbki do analizy metabolomicznej nie będą poddawane wcześniejszemu cyklowi zamrażania/rozmrażania. Z każdej próbki moczu zostanie pobrana porcja 450 μl i dodana do 250 μl roztworu buforowego. Roztwór buforowy zostanie przygotowany przy użyciu roztworu fosforanu potasu o stężeniu 0,5 M i pH 7,4 ± 0,04. Ten roztwór buforowy zawiera również 10 ml azydku sodu, który działa jako środek przeciwdrobnoustrojowy. Rozpuszczalnikiem buforu będzie 1 część D2O na 4 części normalnej wody, a D2O zawiera 0,05 procent wagowych kwasu 3-(trimetylosililo)propionowego-2,2,3,3-d4 (TSP). Ostateczne stężenie TSP zostanie użyte jako wewnętrzny wzorzec przesunięcia chemicznego i oznaczania ilościowego. Roztwór bufor/mocz jest następnie wirowany przy 10 000 obr./min przez pięć minut w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych, dużych tłuszczów lub dużych białek, a następnie 500 μl pipetuje się do probówek NMR o średnicy 5 mm.

Wszystkie widma NMR zostaną uzyskane na spektrometrze Bruker AVANCE III HD 700 MHz (Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Kanada) wyposażonym w platformę do wymiany próbek o dużej przepustowości, sondę potrójnego rezonansu (TBO) 5 mm i oprogramowanie TopSpin 3.2. Każda próbka zostanie pobrana przy użyciu standardowej sekwencji impulsów wstępnego nasycenia Bruker 1D (noesygppr1d) z czasem mieszania 10 ms, czasem akwizycji 5 sekund, opóźnieniem recyklingu wynoszącym 4 sekundy i łącznie 512 skanami. Każda próbka będzie następnie przetwarzana z poszerzeniem linii o 0,3 Hz.

Po wstępnym przetworzeniu w TopSpin 3.2, wszystkie widma zostaną załadowane do matNMR (24), prawidłowo odniesione przez ustawienie przesunięcia TSP na 0 ppm i wyeksportowane do obszaru roboczego Matlab ® w celu dalszego przetwarzania. Widma zostaną następnie podzielone na kategorie przy użyciu metody dynamicznego łączenia adaptacyjnego (DAB), która została zakodowana dla środowiska Matlab. Ta metoda DAB zajmuje się wszelkimi ruchami linii widmowych od widma do widma, które mogą być spowodowane niewielkimi zmianami pH między próbkami (pH = 7,4 ± 0,04) i zapewnia, że ​​piki tego samego metabolitu nie są rozdzielane na różne kosze. Po kategoryzowaniu spektralnym widma zostaną znormalizowane, z wyłączeniem wody i mocznika z normalizacji i przeskalowane w skali Pareto (26). Znormalizowane i przeskalowane widma będą następnie analizowane przy użyciu analizy głównych składowych (PCA) i częściowej analizy dyskryminacyjnej najmniejszych kwadratów (PLS-DA). Wykres ładunków tych dwóch metod zostanie wykorzystany do identyfikacji odległych przedziałów. Zakres przesunięcia chemicznego związany z tymi odległymi pojemnikami zostanie następnie porównany z ustaloną biblioteką metabolitów w celu określenia, które metabolity różnią się między grupami porównawczymi (wstrząs mózgu i stan przed urazem). Narzędzie Eretic w oprogramowaniu TopSpin 3.2 posłuży do określenia zmian ilościowych w stężeniu tych metabolitów. To oznaczenie ilościowe stężenia opiera się na znanym wewnętrznym stężeniu TSP w naszych próbkach NMR. Przeprowadzony zostanie test U Manna Whitneya do analizy metabolicznej oraz dokładny test Fishera dla danych kategorycznych.