Urheiluon liittyvän aivotärähdyksen diagnosointi virtsan aineenvaihduntatuotteiden avulla

Tausta:

Urheilullinen aivotärähdys tai urheiluun liittyvä lievä traumaattinen aivovamma (mTBI) vaikuttaa potilaisiin eri iän, rodun ja sukupuolen mukaan. Se on lääketieteellinen ongelma, jolla voi olla tuhoisia seurauksia potilaille ja perheille, jos sitä ei hoideta asianmukaisesti. MTBI tai aivotärähdys (tässä ehdotuksessa käytetty termi) on viime aikoina ollut kuuma aihe mediassa, kun korkean profiilin poliitikot ja urheilijat ovat muuttaneet uraa aivotärähdyksen jälkeen. Canadian Institute for Health Informationin mukaan urheilu ja virkistystoiminta olivat kolmanneksi yleisin syy TBI-hoitoon Kanadan sairaaloissa vuosina 2003-2004. Yhdysvalloissa Center for Disease Control and Prevention arvioi, että 1,6-3,8 miljoonaa aivotärähdystä tapahtuu vuosittain urheilu- ja virkistystoiminnassa. Vuonna 2013 Calgaryssa noin 10 000 päävamman sairastavaa potilasta nähtiin ensiapuosastolla, joista 80 %:lla diagnosoitiin mTBI ja valtaosa näistä liittyi urheiluun (julkaisematon data).

Tällä hetkellä ei ole olemassa yhtä "kultaisen standardin" arviointia tai diagnostista merkkiä, jonka avulla voitaisiin objektiivisesti määrittää, onko potilas kärsinyt urheilusta aivotärähdyksestä ja jos on, kuinka kauan kestää toipuminen. Sellaisenaan aivotärähdys on edelleen kliininen diagnoosi, joka perustuu trauman jälkeisiin oireisiin, fyysisiin oireisiin ja kognitiivisten toimintojen heikkenemiseen, ja sen tekee parhaimmillaan koulutettu ja kokenut lääketieteen ammattilainen. Mutta tämä on ensisijaisesti laadullinen, yksilöllinen lähestymistapa diagnosointiin, ja sitä varjostaa tyypillisesti objektiivisten kliinisten löydösten puute. Muut arviointityökalut voivat auttaa kliinikkoa aivotärähdyksen diagnosoinnissa, kuten Sport Concussion Assessment Tool 3 (SCAT3) (Liite 1), mutta valitettavasti tätä ei ole validoitu ja se on kehitetty asiantuntijoiden konsensuksen perusteella. Myös tietokoneistettu neuropsykologinen testaus voi auttaa aivotärähdyksen toipumisen arvioinnissa; se on kuitenkin kallista, aikaa vievää ja sitä on äskettäin kritisoitu, koska siitä puuttuu spesifisyys ja herkkyys päänvammojen suhteen.

Viimeisten 20 vuoden aikana tutkijat ovat tutkineet biomarkkereita, kuten S100B:tä ja neuronispesifistä enolaasia, toivoen löytävänsä kvantitatiivisen lähestymistavan aivotärähdyksen diagnosoimiseen ja ennustamiseen. Tämä on valitettavasti kohdannut paljon pettymystä, koska millään näistä markkereista ei sinänsä ole riittävää spesifisyyttä tai herkkyyttä käytettäviksi yhtenä biomarkkerina kliinisessä käytännössä.

Metabolomiikka määritellään "elävien järjestelmien metabolisen vasteen kvantitatiiviseksi mittaukseksi patofysiologisiin ärsykkeisiin tai geneettiseen modifikaatioon", ja se perustuu analyyttisiin alustoihin, kuten protoniydinmagneettiresonanssispektroskopiaan (1H NMR) ja/tai massaspektrometriaan. Kliinisesti saatavilla olevien bionesteiden, kuten veren ja virtsan, metaboliset tutkimukset tarjoavat monimutkaisen ja suhteellisen ei-invasiivisen tilannekuvan tähän vasteeseen. Tähän mennessä metabolomiikka on osoittautunut hyödylliseksi biomarkkerityökaluksi amyotrofisessa lateraaliskleroosissa, Alzheimerin taudissa, Parkinsonin taudissa, vastasyntyneiden hypoksisessa iskeemisessä enkefalopatiassa, aivosyövässä, multippeliskleroosissa, ikääntymisessä ja hermostoa rappeuttavassa sairaudessa, epilepsiassa, aivohalvauksessa, vakavassa traumaattisessa aivovauriossa ja lasten hoidossa. septinen shokki. Tietojemme mukaan missään tutkimuksessa ei ole arvioitu kvantitatiivista metabolomista profilointia diagnostisena ja ennustavana työkaluna urheilullisen aivotärähdyksen yhteydessä.

Tämä pilottitutkimus auttaisi seuraavissa asioissa:

1. Selvittää metabolomiikan testauksen toteutettavuus urheilun aivotärähdyspopulaatiossa.
2. Ensimmäinen laatuaan tutkimus, jossa käytettiin kvantitatiivista metabolista profilointia akuutin urheilullisen aivotärähdyksen diagnosoinnissa.
3. Ensimmäinen laatuaan tutkimus, jossa kehitettiin metabolinen "sormenjälki", joka voi auttaa ennustamaan toipumista akuutista urheilusta johtuvasta aivotärähdyksestä.

Koehenkilöitä pyydetään toimittamaan virtsanäyte keskivirtauksesta klo 7-9 välillä ennen vammoja ja aivotärähdyksen jälkeen. Virtsaerät otetaan välittömästi sentrifugoimalla ja säilytetään sitten -80 °C:ssa, kunnes niitä tarvitaan analyysiin. Kun kaikki näytteet on kerätty, ne eristetään ja kuljetetaan Lethbridgen yliopistoon analysoitavaksi.

Yhtään metabolomista analyysiä varten ei käytetä aiempaa jäädytys/sulatusjaksoa. Jokaisesta virtsanäytteestä otetaan 450 μl:n alikvootti ja lisätään 250 μl:aan puskuriliuosta. Puskuriliuos valmistetaan käyttämällä kaliumfosfaattiliuosta 0,5 M ja pH 7,4 ± 0,04. Tämä puskuriliuos sisältää myös 10 ml natriumatsidia, joka toimii antimikrobisena aineena. Puskurin liuotin on 1 osa D2O:ta 4 osaan normaalia vettä ja D2O sisältää 0,05 painoprosenttia 3-(trimetyylisilyyli)propioni-2,2,3,3-d4-happoa (TSP). TSP:n lopullista pitoisuutta käytetään sisäisenä kemiallisena siirtymänä ja kvantifiointistandardina. Puskuri/virtsaliuosta sentrifugoidaan sitten nopeudella 10 000 rpm viiden minuutin ajan hiukkasten, suurten rasvojen tai suurten proteiinien poistamiseksi ja 500 μl pipetoidaan 5 mm:n NMR-putkiin.

Kaikki NMR-spektrit saadaan Bruker AVANCE III HD 700 MHz spektrometrillä (Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Kanada), joka on varustettu korkean suorituskyvyn näytteenvaihtoalustalla, kolmoisresonanssilla (TBO) 5 mm:llä ja TopSpin 3.2 -ohjelmistolla. Jokainen näyte hankitaan käyttämällä tavallista Bruker 1D:n esikyllästyspulssisekvenssiä (noesygppr1d), jonka sekoitusaika on 10 ms, hankintaaika 5 sekuntia, kierrätysviive 4 sekuntia ja yhteensä 512 skannausta. Jokainen näyte käsitellään sitten 0,3 Hz:n viivalevennyksellä.

Alkukäsittelyn jälkeen TopSpin 3.2:ssa kaikki spektrit ladataan matNMR:ään (24), viitataan oikein asettamalla TSP-siirtymä arvoon 0 ppm ja viedään Matlab ® -työtilaan jatkokäsittelyä varten. Spektrit bindataan sitten käyttämällä dynaamista adaptiivista binning (DAB) -menetelmää, joka on koodattu Matlab-ympäristöön. Tämä DAB-menetelmä käsittelee mitä tahansa spektrilinjojen liikettä spektristä spektreihin, jotka voivat johtua pienestä pH:n vaihtelusta näytteestä toiseen (pH = 7,4 ± 0,04), ja varmistaa, että saman metaboliitin piikit eivät hajoa eri osiin. roskakorit. Spektribinningin jälkeen spektrit normalisoidaan, vesi ja urea jätetään normalisoinnin ulkopuolelle, ja Pareto skaalataan (26). Normalisoidut ja skaalatut spektrit analysoidaan sitten käyttämällä pääkomponenttianalyysiä (PCA) ja osittaista pienimmän neliösumman erotteluanalyysiä (PLS-DA). Näiden kahden menetelmän lastauskäyrää käytetään syrjäisten roskakorien tunnistamiseen. Näihin syrjäisiin säiliöihin liittyvää kemiallista siirtymäaluetta verrataan sitten vakiintuneeseen metaboliittikirjastoon sen määrittämiseksi, millä metaboliiteilla on vaihtelua vertailuryhmien välillä (aivotärähdys ja esivamma). TopSpin 3.2 -ohjelmiston Eretic-työkalua käytetään näiden metaboliittien pitoisuuksien kvantitatiivisten muutosten määrittämiseen. Tämä pitoisuuden kvantifiointi perustuu tunnettuun sisäiseen TSP-pitoisuuteen NMR-näytteissämme. Suoritetaan Mann Whitney U -testi aineenvaihduntaanalyysiä varten ja Fisherin tarkka testi kategorisille tiedoille.