Diagnose einer sportbedingten Gehirnerschütterung anhand von Urin-Metaboliten

Hintergrund:

Sportliche Gehirnerschütterungen oder sportbedingte leichte traumatische Hirnverletzungen (mTBI) betreffen Patienten aller Altersgruppen, Rassen und Geschlechter. Es ist ein medizinisches Problem, das, wenn es nicht angemessen behandelt wird, verheerende Folgen für Patienten und Familien haben kann. MTBI oder Gehirnerschütterung (in diesem Vorschlag synonym verwendete Terminologie) war in jüngerer Zeit ein heißes Thema in den Medien, da hochkarätige Politiker und Sportler nach einer Gehirnerschütterung karriereverändernde Folgen hatten. Nach Angaben des Canadian Institute for Health Information waren Sport- und Freizeitaktivitäten in den Jahren 2003-2004 die dritthäufigste Ursache für SHT-Aufnahmen in kanadischen Krankenhäusern. In den Vereinigten Staaten schätzt das Center for Disease Control and Prevention, dass jährlich 1,6 bis 3,8 Millionen Gehirnerschütterungen bei Sport- und Freizeitaktivitäten auftreten. In Calgary wurden im Jahr 2013 etwa 10.000 Patienten in den Notaufnahmen mit einer Kopfverletzung behandelt, von denen 80 % als mTBI diagnostiziert wurden und die überwiegende Mehrheit davon sportbedingt war (unveröffentlichte Daten).

Derzeit gibt es keinen einzigen "Goldstandard" für die Bewertung oder diagnostischen Marker, um objektiv festzustellen, ob ein Patient eine Sport-Gehirnerschütterung erlitten hat und wenn ja, wie lange es dauern wird, bis er sich erholt hat. Daher bleibt die Gehirnerschütterung eine klinische Diagnose, die auf posttraumatischen Symptomen, körperlichen Anzeichen und einer Beeinträchtigung der kognitiven Funktion basiert und bestenfalls von einem ausgebildeten und erfahrenen Arzt durchgeführt wird. Dies ist jedoch in erster Linie ein qualitativer, individualisierter Diagnoseansatz und wird typischerweise durch einen Mangel an objektiven klinischen Befunden getrübt. Andere Bewertungsinstrumente können einem Arzt bei der Diagnose einer Gehirnerschütterung helfen, wie z. B. das Sport Concussion Assessment Tool 3 (SCAT3) (Anhang 1), aber leider wurde dies nicht validiert und wurde auf der Grundlage von Expertenkonsens entwickelt. Ebenso können computergestützte neuropsychologische Tests bei der Beurteilung der Genesung nach einer Gehirnerschütterung helfen; es ist jedoch teuer, zeitaufwändig und wurde kürzlich wegen fehlender Spezifität und Sensitivität für Kopfverletzungen kritisiert.

In den letzten 20 Jahren haben Forscher Biomarker wie S100B und neuronenspezifische Enolase untersucht, in der Hoffnung, einen quantitativen Ansatz zur Diagnose und Prognose von Gehirnerschütterungen zu finden. Dies hat leider zu großer Enttäuschung geführt, da keiner dieser Marker an und für sich eine ausreichende Spezifität oder Sensitivität aufweist, um als einzelner Biomarker in der klinischen Praxis verwendet zu werden.

Metabolomik ist definiert als „die quantitative Messung der metabolischen Reaktion lebender Systeme auf pathophysiologische Stimuli oder genetische Veränderungen“ und basiert auf analytischen Plattformen wie der Protonen-Kernspinresonanzspektroskopie (1H-NMR) und/oder der Massenspektrometrie. Metabolomstudien an klinisch zugänglichen Bioflüssigkeiten wie Blut und Urin liefern eine komplizierte und relativ nicht-invasive Momentaufnahme dieser Reaktion. Bis heute hat sich die Metabolomik als nützliches Biomarker-Tool bei amyotropher Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, neonataler hypoxischer ischämischer Enzephalopathie, Hirntumor, Multipler Sklerose, Alterung und neurodegenerativen Erkrankungen, Epilepsie, Schlaganfall, schwerer traumatischer Hirnverletzung und Pädiatrie erwiesen septischer Schock. Nach unserem besten Wissen hat keine Studie quantitative metabolomische Profilerstellung als diagnostisches und prognostisches Instrument bei Gehirnerschütterungen im Sport bewertet.

Diese Pilotstudie würde zu Folgendem beitragen:

1. Bestimmung der Durchführbarkeit von Metabolomics-Tests in der Sport-Gehirnerschütterungs-Population.
2. Die erste Studie dieser Art, die ein quantitatives metabolisches Profiling verwendet, um die Diagnose einer akuten Sport-Gehirnerschütterung zu unterstützen.
3. Die erste Studie dieser Art zur Entwicklung eines metabolischen „Fingerabdrucks“, der bei der Vorhersage der Genesung bei einer akuten Sport-Gehirnerschütterung helfen kann.

Die Probanden werden gebeten, zwischen 7 und 9 Uhr vor der Verletzung und nach der Gehirnerschütterung eine Mittelstrahl-Urinprobe abzugeben. Urinaliquots werden sofort durch Zentrifugieren gewonnen und dann bei -80 °C gelagert, bis sie für die Analyse benötigt werden. Sobald alle Proben gesammelt sind, werden sie gebündelt und zur Analyse an die University of Lethbridge transportiert.

Keine Proben für die Metabolomanalyse werden einem vorherigen Einfrier-/Auftauzyklus unterzogen. Aus jeder Urinprobe wird ein Aliquot von 450 µl entnommen und zu 250 µl Pufferlösung gegeben. Die Pufferlösung wird unter Verwendung einer Kaliumphosphatlösung mit 0,5 M und pH 7,4 ± 0,04 hergestellt. Diese Pufferlösung enthält außerdem 10 ml Natriumazid, das als antimikrobielles Mittel wirkt. Das Lösungsmittel für den Puffer besteht aus 1 Teil D2O auf 4 Teile normales Wasser und das D2O enthält 0,05 Gewichtsprozent 3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3-d4-Säure (TSP). Die Endkonzentration von TSP wird als interner chemischer Verschiebungs- und Quantifizierungsstandard verwendet. Die Puffer/Urin-Lösung wird dann fünf Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert, um Partikel, große Fette oder große Proteine ​​zu entfernen, und 500 μl werden in 5-mm-NMR-Röhrchen pipettiert.

Alle NMR-Spektren werden auf einem Bruker AVANCE III HD 700 MHz-Spektrometer (Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Kanada) erhalten, das mit einer Hochdurchsatz-Probenwechslerplattform, einer 5-mm-Sonde mit Dreifachresonanz (TBO) und TopSpin 3.2-Software ausgestattet ist. Jede Probe wird unter Verwendung der standardmäßigen Bruker 1D-Vorsättigungsimpulssequenz (noesygppr1d) mit einer Mischzeit von 10 ms, einer Erfassungszeit von 5 Sekunden, einer Wiederverwendungsverzögerung von 4 Sekunden und insgesamt 512 Scans erfasst. Jedes Sample wird dann mit einer Linienverbreiterung von 0,3 Hz verarbeitet.

Nach der anfänglichen Verarbeitung in TopSpin 3.2 werden alle Spektren in matNMR (24) geladen, korrekt referenziert, indem die TSP-Verschiebung auf 0 ppm gesetzt wird, und zur weiteren Verarbeitung in den Matlab ® -Arbeitsbereich exportiert. Die Spektren werden dann unter Verwendung eines dynamischen adaptiven Binning-Verfahrens (DAB), das für die Matlab-Umgebung codiert wurde, gebinnt. Diese DAB-Methode befasst sich mit jeder Bewegung der Spektrallinien von Spektrum zu Spektrum, die durch leichte Schwankungen des pH-Werts von Probe zu Probe (pH = 7,4 ± 0,04) verursacht werden kann, und stellt sicher, dass Peaks desselben Metaboliten nicht in verschiedene zerlegt werden Mülleimer. Nach dem spektralen Binning werden die Spektren normalisiert, wobei Wasser und Harnstoff von der Normalisierung ausgeschlossen werden, und Pareto-skaliert (26). Die normalisierten und skalierten Spektren werden dann mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) und partieller kleinster quadratischer Diskriminanzanalyse (PLS-DA) analysiert. Das Ladungsdiagramm dieser beiden Methoden wird zum Identifizieren der äußeren Bins verwendet. Der mit diesen abgelegenen Behältern verbundene chemische Verschiebungsbereich wird dann mit einer etablierten Metabolitenbibliothek verglichen, um zu bestimmen, welche Metaboliten zwischen den Vergleichsgruppen (Gehirnerschütterung und Vorverletzung) variieren. Das Eretik-Tool in der TopSpin 3.2-Software wird verwendet, um die quantitativen Änderungen in der Konzentration dieser Metaboliten zu bestimmen. Diese Quantifizierung der Konzentration basiert auf der bekannten internen Konzentration von TSP in unseren NMR-Proben. Ein Mann-Whitney-U-Test für die Stoffwechselanalyse und ein exakter Fisher-Test für die kategorialen Daten werden durchgeführt.