Sporttal kapcsolatos agyrázkódás diagnosztizálása vizelet metabolitok segítségével

Háttér:

A sportos agyrázkódás vagy a sporttal összefüggő enyhe traumás agysérülés (mTBI) a betegek életkora, faji és nemi hovatartozása szerint érinti a betegeket. Ez egy olyan orvosi probléma, amely megfelelő kezelés hiányában pusztító következményekkel járhat a betegek és a családok számára. Az MTBI vagy agyrázkódás (a javaslatban felváltva használt terminológia) az utóbbi időben a médiában felkapott téma, ahol a magas rangú politikusok és sportolók pályafutását megváltoztatták egy agyrázkódást követően. A Kanadai Egészségügyi Információs Intézet szerint 2003 és 2004 között a sport és a szabadidős tevékenységek voltak a harmadik vezető ok a kanadai kórházakban a TBI-bevételek körében. Az Egyesült Államokban a Betegségellenőrzési és Megelőzési Központ becslései szerint évente 1,6-3,8 millió agyrázkódás történik sport- és szabadidős tevékenységek során. Calgaryban 2013-ban körülbelül 10 000 beteget láttak a sürgősségi osztályokon fejsérüléssel, ezek 80%-ánál mTBI-t diagnosztizáltak, és ezek túlnyomó többsége sporttal kapcsolatos (nem publikált adatok).

Jelenleg nincs egyetlen "arany standard" értékelés vagy diagnosztikai marker, amely objektív módon meghatározná, hogy a beteg szenvedett-e sportrázkódást, és ha igen, mennyi ideig tart a felépülése. Mint ilyen, az agyrázkódás a poszttraumás tüneteken, fizikai jeleken és a kognitív funkciók károsodásán alapuló klinikai diagnózis marad, amelyet legjobb esetben képzett és tapasztalt egészségügyi szakember végez. Ez azonban elsősorban a diagnózis kvalitatív, egyénre szabott megközelítése, és jellemzően az objektív klinikai leletek hiánya miatt homályos. Más értékelési eszközök segíthetnek a klinikusnak az agyrázkódás diagnosztizálásában, mint például a Sport Concussion Assessment Tool 3 (SCAT3) (1. melléklet), de sajnos ezt nem validálták, és szakértői konszenzus alapján fejlesztették ki. Emellett a számítógépes neuropszichológiai tesztelés segíthet az agyrázkódásból származó felépülés értékelésében; azonban drága, időigényes, és a közelmúltban kritizálták, mivel nincs specifikus és érzékeny a fejsérülésekre.

Az elmúlt 20 évben a kutatók olyan biomarkereket tanulmányoztak, mint az S100B és a neuron-specifikus enoláz, abban a reményben, hogy kvantitatív megközelítést találnak az agyrázkódás diagnosztizálására és prognosztizálására. Ez sajnos nagy csalódást okozott, mivel ezeknek a markereknek egyike sem rendelkezik megfelelő specifitással vagy érzékenységgel ahhoz, hogy egyetlen biomarkerként használhassák a klinikai gyakorlatban.

A metabolomika meghatározása szerint "az élő rendszerek patofiziológiai ingerekre vagy genetikai módosításokra adott metabolikus válaszának kvantitatív mérése", és olyan analitikai platformokon alapul, mint a protonmagmágneses rezonancia spektroszkópia (1H NMR) és/vagy tömegspektrometria. A klinikailag hozzáférhető biofolyadékok, például a vér és a vizelet metabolikus vizsgálatai bonyolult és viszonylag nem invazív pillanatképet adnak erre a válaszra. A mai napig a metabolomika hasznos biomarker eszköznek bizonyult amyotrophiás laterális szklerózis, Alzheimer-kór, Parkinson-kór, újszülöttkori hipoxiás ischaemiás encephalopathia, agyrák, sclerosis multiplex, öregedés és neurodegeneratív betegségek, epilepszia, szélütés, súlyos traumás agysérülés és gyermekkori betegségek esetén. szeptikus sokk. Legjobb tudomásunk szerint egyetlen tanulmány sem értékelte a kvantitatív metabolomikus profilalkotást diagnosztikai és prognosztizáló eszközként a sport agyrázkódásában.

Ez a kísérleti tanulmány a következőkben nyújt segítséget:

1. Meghatározni a metabolomika tesztelésének megvalósíthatóságát a sport agyrázkódásos populációjában.
2. Az első ilyen jellegű tanulmány, amely kvantitatív metabolikus profilalkotást alkalmaz az akut sportrázkódás diagnosztizálására.
3. Az első ilyen jellegű tanulmány egy olyan metabolikus "ujjlenyomat" kifejlesztésére, amely segíthet a felépülés előrejelzésében akut sportrázkódás esetén.

Az alanyokat felkérik, hogy a sérülés előtt és az agyrázkódás után reggel 7 és 9 óra között adjanak vizeletmintát a középső áramlásban. A vizelet aliquot részeket azonnal centrifugálással vesszük ki, majd -80 C-on tároljuk az elemzéshez. Miután az összes mintát összegyűjtötték, csoportosítják és a Lethbridge-i Egyetemre szállítják elemzés céljából.

A metabolomikus elemzésre szánt minták nem esnek át előző fagyasztási/olvadási cikluson. Minden vizeletmintából 450 μl-es alikvot részt vesznek, és 250 μl pufferoldathoz adják. A pufferoldatot 0,5 M kálium-foszfát-oldattal, pH 7,4 ± 0,04 értékkel készítjük. Ez a pufferoldat 10 ml nátrium-azidot is tartalmaz, amely antimikrobiális szerként működik. A puffer oldószere 1 rész D2O és 4 rész normál víz, a D2O pedig 0,05 tömeg% 3-(trimetil-szilil)-propionsavat (TSP) tartalmaz. A TSP végső koncentrációját belső kémiai eltolódási és mennyiségi meghatározási standardként fogják használni. A puffer/vizelet oldatot ezután 10 000 fordulat/perc sebességgel centrifugálják öt percig, hogy eltávolítsák a részecskéket, a nagy zsírokat vagy a nagy fehérjéket, és 500 μl-t pipettáznak 5 mm-es NMR-csövekbe.

Az összes NMR-spektrumot Bruker AVANCE III HD 700 MHz spektrométeren (Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Kanada) veszik fel, amely nagy áteresztőképességű mintaváltó platformmal, hármas rezonancia (TBO) 5 mm-es szondával és TopSpin 3.2 szoftverrel van felszerelve. Minden egyes mintát a standard Bruker 1D előtelítési impulzusszekvenciával (noesygppr1d) használunk, 10 ms keverési idővel, 5 másodperces felvételi idővel, 4 másodperces újraciklus-késleltetéssel és összesen 512 pásztázással. Ezután minden mintát 0,3 Hz-es vonalszélesítéssel dolgozunk fel.

A TopSpin 3.2-ben történő kezdeti feldolgozás után az összes spektrum betöltődik a matNMR-be (24), a TSP eltolást 0 ppm-re állítva helyesen hivatkozik rá, és a Matlab ® munkaterületére exportálja további feldolgozás céljából. A spektrumokat ezután a Matlab környezethez kódolt dinamikus adaptív binning (DAB) módszerrel binnilik. Ez a DAB-módszer kezeli a spektrumvonalak spektrumról spektrumra történő mozgását, amelyet a pH enyhe változása okozhat mintáról mintára (pH = 7,4 ± 0,04), és biztosítja, hogy ugyanazon metabolit csúcsai ne váljanak szét különböző részekre. kukák. A spektrális binning után a spektrumokat normalizáljuk, a vizet és a karbamidot kizárjuk a normalizálásból, és Pareto-skálát alkalmazunk (26). A normalizált és skálázott spektrumokat ezután főkomponens-analízis (PCA) és részleges legkisebb négyzetes diszkriminancia-analízis (PLS-DA) segítségével elemzik. Ennek a két módszernek a terhelési grafikonját fogjuk használni a külterületi tartályok azonosítására. Az ezekhez a távoli tartályokhoz kapcsolódó kémiai eltolódási tartományt ezután összehasonlítják egy kialakult metabolit-könyvtárral, hogy meghatározzák, mely metabolitok különböznek az összehasonlító csoportokban (agyrázkódás és sérülés előtti). A TopSpin 3.2 szoftverben található Eretic eszközt fogják használni ezen metabolitok koncentrációjának mennyiségi változásának meghatározására. A koncentráció ezen mennyiségi meghatározása a TSP ismert belső koncentrációján alapul NMR mintáinkban. A metabolikus elemzéshez Mann Whitney U-tesztet, a kategorikus adatokhoz Fisher-tesztet végeznek.