Diagnose af sportsrelateret hjernerystelse ved hjælp af urinmetabolitter

Baggrund:

Sport hjernerystelse eller sportsrelateret mild traumatisk hjerneskade (mTBI) påvirker patienter på tværs af spektret af alder, race og køn. Det er et medicinsk problem, som, hvis det ikke behandles korrekt, kan have ødelæggende konsekvenser for patienter og familier. MTBI eller hjernerystelse (terminologi brugt i flæng i dette forslag) har for nylig været et varmt emne i medierne med højt profilerede politikere og atleter, der har ændret karriere efter en hjernerystelse. Ifølge Canadian Institute for Health Information var sport og fritidsaktiviteter den tredje førende årsag til TBI-indlæggelser på canadiske hospitaler i 2003-2004. I USA anslår Center for Disease Control and Prevention, at 1,6 til 3,8 millioner hjernerystelser opstår i sports- og fritidsaktiviteter årligt. I Calgary blev cirka 10.000 patienter set på akutmodtagelserne med en hovedskade i 2013, hvoraf 80% blev diagnosticeret som mTBI, og langt størstedelen af ​​disse var sportsrelaterede (upublicerede data).

I øjeblikket er der ingen enkelt "guldstandard"-vurdering eller diagnostisk markør til objektivt at bestemme, om en patient har fået en sports hjernerystelse, og i så fald hvor lang tid det vil tage at komme sig. Som sådan forbliver hjernerystelse en klinisk diagnose baseret på posttraumatiske symptomer, fysiske tegn og svækkelse af kognitiv funktion, som i bedste fald udføres af en uddannet og erfaren læge. Men dette er primært en kvalitativ, individualiseret tilgang til diagnosticering og er typisk overskygget af mangel på objektive kliniske fund. Andre vurderingsværktøjer kan hjælpe en kliniker med at diagnosticere en hjernerystelse, såsom Sport Concussion Assessment Tool 3 (SCAT3) (bilag 1), men desværre er dette ikke blevet valideret og blev udviklet baseret på ekspertkonsensus. Ligeledes kan computeriseret neuropsykologisk testning hjælpe med vurderingen af ​​genopretning af hjernerystelse; det er dog dyrt, tidskrævende og er for nylig blevet kritiseret for at mangle specificitet og følsomhed for hovedskader.

I løbet af de sidste 20 år har forskere studeret biomarkører som S100B og neuronspecifik enolase i håb om at finde en kvantitativ tilgang til diagnosticering og prognostisering af hjernerystelse. Dette har desværre mødt stor skuffelse, da ingen af ​​disse markører i sig selv har tilstrækkelig specificitet eller sensitivitet til at blive brugt som en enkelt biomarkør i klinisk praksis.

Metabolomics er defineret som "den kvantitative måling af levende systemers metaboliske respons på patofysiologiske stimuli eller genetisk modifikation" og er baseret på analytiske platforme såsom protonkernemagnetisk resonansspektroskopi (1H NMR) og/eller massespektrometri. Metabolomiske undersøgelser af klinisk tilgængelige biovæsker, såsom blod og urin, giver et indviklet og relativt ikke-invasivt øjebliksbillede af denne reaktion. Til dato har metabolomics vist sig at være et nyttigt biomarkørværktøj ved amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom, neonatal hypoxisk iskæmisk encefalopati, hjernekræft, multipel sklerose, aldring og neurodegenerativ sygdom, epilepsi, slagtilfælde, alvorlig traumatisk hjerneskade og pædiatio. septisk chok. Så vidt vi ved, har ingen undersøgelse vurderet kvantitativ metabolomisk profilering som et diagnostisk og prognosticerende værktøj ved sportshjernerystelse.

Denne pilotundersøgelse vil hjælpe med følgende:

1. For at bestemme gennemførligheden af ​​at teste metabolomics i sport hjernerystelse befolkningen.
2. Den første undersøgelse af sin art, der bruger kvantitativ metabolisk profilering til at hjælpe med diagnosticering af akut sports hjernerystelse.
3. Den første undersøgelse af sin art til at udvikle et metabolisk "fingeraftryk", der kan hjælpe med at forudsige genopretning ved akut sports hjernerystelse.

Forsøgspersonerne vil blive bedt om at give en urinprøve midtvejs mellem kl. 7-9 om morgenen før skaden og efter hjernerystelse. Urinalikvoter vil blive opnået med det samme ved centrifugering og derefter opbevaret ved -80C, indtil de kræves til analyse. Når alle prøver er indsamlet, vil de blive batchet og transporteret til University of Lethbridge til analyse.

Ingen prøver til metabolomisk analyse vil gennemgå en tidligere fryse/tø-cyklus. En alikvot på 450 μl fjernes fra hver af urinprøverne og tilsættes 250 μl bufferopløsning. Bufferopløsningen vil blive fremstillet under anvendelse af en kaliumphosphatopløsning ved 0,5 M og pH 7,4 ± 0,04. Denne bufferopløsning indeholder også 10 ml natriumazid, som virker som et antimikrobielt middel. Opløsningsmidlet til bufferen vil 1 del D2O til 4 dele normalt vand, og D2O indeholder 0,05 vægtprocent 3-(trimethylsilyl)propionsyre-2,2,3,3-d4-syre (TSP). Den endelige koncentration af TSP vil blive brugt som en intern standard for kemisk skift og kvantificering. Buffer/urinopløsningen centrifugeres derefter ved 10 000 rpm i fem minutter for at fjerne partikler, store fedtstoffer eller store proteiner, og 500 μl pipetteres i 5 mm NMR-rør.

Alle NMR-spektre vil blive opnået på et Bruker AVANCE III HD 700 MHz spektrometer (Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Canada) udstyret med en high-throughput prøveskifterplatform, en triple resonance (TBO) 5 mm sonde og TopSpin 3.2 software. Hver prøve vil blive erhvervet ved hjælp af standard Bruker 1D præ-mætning pulssekvens (noesygppr1d) med en blandingstid på 10 ms, en optagelsestid på 5 sekunder, en genbrugsforsinkelse på 4 sekunder og i alt 512 scanninger. Hver prøve vil derefter blive behandlet med en linjeudvidelse på 0,3 Hz.

Efter indledende bearbejdning i TopSpin 3.2 vil alle spektre blive indlæst i matNMR (24), der henvises korrekt til ved at indstille TSP-skiftet til 0 ppm og eksporteres til Matlab ® -arbejdsområdet for yderligere behandling. Spektrene vil derefter blive lagret ved hjælp af en dynamisk adaptiv binning (DAB) metode, der er blevet kodet til Matlab-miljøet. Denne DAB-metode behandler enhver bevægelse i spektrallinjer fra spektre til spektre, som kan være forårsaget af en lille variation i pH fra prøve til prøve (pH = 7,4 ± 0,04), og sikrer, at toppe fra den samme metabolit ikke brydes fra hinanden i forskellige skraldespande. Efter spektral binning vil spektrene blive normaliseret, med vand og urinstof udelukket fra normaliseringen, og Pareto skaleret (26). De normaliserede og skalerede spektre vil derefter blive analyseret ved hjælp af principal komponent analyse (PCA) og Partial Least Squared Discriminant Analysis (PLS-DA). Indlæsningsplottet for disse to metoder vil blive brugt til at identificere de afsidesliggende beholdere. Det kemiske skiftområde forbundet med disse afsidesliggende beholdere vil derefter blive sammenlignet med et etableret metabolitbibliotek for at bestemme, hvilke metabolitter der har variation på tværs af sammenligningsgrupper (hjernerystelse og før-skade). Eretisk værktøj i TopSpin 3.2-softwaren vil blive brugt til at bestemme de kvantitative ændringer i koncentrationen af ​​disse metabolitter. Denne kvantificering af koncentrationen er baseret på den kendte interne koncentration af TSP i vores NMR-prøver. En Mann Whitney U-test til metabolisk analyse og en Fisher eksakt test for de kategoriske data vil blive udført.