Diagnostika otřesu mozku souvisejícího se sportem pomocí metabolitů moči

Pozadí:

Sportovní otřes mozku nebo lehké traumatické poranění mozku související se sportem (mTBI) postihuje pacienty napříč spektrem věku, rasy a pohlaví. Jde o zdravotní problém, který, pokud není řádně léčen, může mít pro pacienty a rodiny zničující následky. MTBI nebo otřes mozku (terminologie používaná v tomto návrhu zaměnitelně) se v poslední době stal horkým tématem v médiích s vysokými profily politiků a sportovců, kteří po otřesu mozku změnili kariéru. Podle Kanadského institutu pro zdravotnické informace byly sportovní a rekreační aktivity v letech 2003-2004 třetí hlavní příčinou přijetí TBI v kanadských nemocnicích. Ve Spojených státech Centrum pro kontrolu a prevenci nemocí odhaduje, že ročně dojde při sportovních a rekreačních aktivitách k 1,6 až 3,8 milionu otřesů mozku. V Calgary bylo v roce 2013 na pohotovostních odděleních spatřeno přibližně 10 000 pacientů s poraněním hlavy, z nichž 80 % bylo diagnostikováno jako mTBI a velká většina z nich se týkala sportu (nepublikované údaje).

V současné době neexistuje jediný „zlatý standard“ hodnocení nebo diagnostický marker, který by objektivně určil, zda pacient utrpěl sportovní otřes mozku, a pokud ano, jak dlouho bude trvat, než se zotaví. Otřes mozku jako takový zůstává klinickou diagnózou založenou na posttraumatických příznacích, fyzických příznacích a zhoršení kognitivních funkcí, kterou v nejlepším případě provádí vyškolený a zkušený lékař. Jedná se však především o kvalitativní, individualizovaný přístup k diagnostice a je obvykle zatemněn nedostatkem objektivních klinických nálezů. Jiné hodnotící nástroje mohou lékaři pomoci při diagnostice otřesu mozku, jako je Sport Concussion Assessment Tool 3 (SCAT3) (příloha 1), ale bohužel tento nástroj nebyl ověřen a byl vyvinut na základě konsenzu odborníků. Počítačové neuropsychologické testování může také pomoci s hodnocením zotavení z otřesu mozku; je však nákladný, časově náročný a nedávno byl kritizován jako nedostatek specifičnosti a citlivosti pro poranění hlavy.

Během posledních 20 let vědci studovali biomarkery, jako je S100B a neuron-specifická enoláza, v naději, že najdou kvantitativní přístup k diagnostice a prognostice otřesu mozku. To se bohužel setkalo s velkým zklamáním, protože žádný z těchto markerů sám o sobě nemá adekvátní specificitu nebo senzitivitu, aby mohl být použit jako jediný biomarker v klinické praxi.

Metabolomika je definována jako „kvantitativní měření metabolické odezvy živých systémů na patofyziologické podněty nebo genetickou modifikaci“ a je založena na analytických platformách, jako je protonová nukleární magnetická rezonanční spektroskopie (1H NMR) a/nebo hmotnostní spektrometrie. Metabolomické studie klinicky dostupných biologických tekutin, jako je krev a moč, poskytují složitý a relativně neinvazivní snímek této odpovědi. K dnešnímu dni se metabolomika ukázala jako užitečný nástroj biomarkerů u amyotrofické laterální sklerózy, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby, neonatální hypoxické ischemické encefalopatie, rakoviny mozku, roztroušené sklerózy, stárnutí a neurodegenerativních onemocnění, epilepsie, mrtvice, těžkého traumatického poranění mozku a pediatrie. septický šok. Podle našich nejlepších znalostí žádná studie nehodnotila kvantitativní metabolomické profilování jako diagnostický a prognostický nástroj u sportovních otřesů mozku.

Tato pilotní studie by pomohla v následujícím:

1. Zjistit proveditelnost testování metabolomiky v populaci sportovních otřesů mozku.
2. První studie svého druhu využívající kvantitativní metabolické profilování pro pomoc s diagnózou akutního sportovního otřesu mozku.
3. První studie svého druhu, která vyvinula metabolický "otisk prstu", který může pomoci předpovídat zotavení při akutním sportovním otřesu mozku.

Subjekty budou požádány, aby poskytly vzorek moči středního proudu mezi 7-9 hodinou ráno před poraněním a po otřesu mozku. Alikvoty moči budou okamžitě získány odstředěním a poté skladovány při -80 °C, dokud nejsou potřebné pro analýzu. Jakmile budou všechny vzorky odebrány, budou dávkovány a přepraveny na University of Lethbridge k analýze.

Žádné vzorky pro metabolomickou analýzu nepodstoupí předchozí cyklus zmrazení/rozmrazení. Z každého vzorku moči se odebere alikvot 450 μl a přidá se do 250 μl tlumivého roztoku. Roztok pufru bude připraven s použitím roztoku fosforečnanu draselného o koncentraci 0,5 M a pH 7,4 ± 0,04. Tento tlumivý roztok také obsahuje 10 ml azidu sodného, ​​který působí jako antimikrobiální činidlo. Rozpouštědlo pro pufr bude 1 díl D2O na 4 díly normální vody a D2O obsahuje 0,05 hmotnostních procent kyseliny 3-(trimethylsilyl)propionové-2,2,3,3-d4 (TSP). Konečná koncentrace TSP bude použita jako vnitřní chemický posun a kvantifikační standard. Roztok pufru/moč se poté odstřeďuje při 10 000 ot./min po dobu pěti minut, aby se odstranily veškeré částice, velké tuky nebo velké proteiny, a 500 μl se odpipetuje do 5 mm NMR zkumavek.

Všechna NMR spektra budou získána na spektrometru Bruker AVANCE III HD 700 MHz (Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Kanada) vybaveném platformou vysokokapacitního měniče vzorků, 5mm sondou s trojitou rezonancí (TBO) a softwarem TopSpin 3.2. Každý vzorek bude získán pomocí standardní předsaturační pulzní sekvence Bruker 1D (noesygppr1d) s dobou míchání 10 ms, dobou akvizice 5 sekund, zpožděním recyklace 4 sekundy a celkem 512 skeny. Každý vzorek bude poté zpracován s rozšířením čáry o 0,3 Hz.

Po počátečním zpracování v TopSpin 3.2 budou všechna spektra načtena do matNMR (24), správně odkazována nastavením posunu TSP na 0 ppm a exportována do pracovního prostoru Matlab ® k dalšímu zpracování. Spektra pak budou binována pomocí metody dynamického adaptivního binningu (DAB), která byla zakódována pro prostředí Matlab. Tato metoda DAB se zabývá jakýmkoliv pohybem spektrálních čar od spekter ke spektru, který může být způsoben mírnou změnou pH mezi vzorky (pH = 7,4 ± 0,04), a zajišťuje, že píky ze stejného metabolitu nejsou rozděleny na různé popelnice. Po spektrálním binningu budou spektra normalizována, přičemž voda a močovina budou vyloučeny z normalizace, a upravena podle Pareta (26). Normalizovaná a škálovaná spektra pak budou analyzována pomocí analýzy hlavních složek (PCA) a parciální analýzy nejmenších čtverců diskriminační analýzy (PLS-DA). Graf zatížení těchto dvou metod bude použit pro identifikaci odlehlých zásobníků. Rozsah chemického posunu spojený s těmito odlehlými zásobníky bude poté porovnán se zavedenou knihovnou metabolitů, aby se určilo, které metabolity se liší mezi srovnávacími skupinami (otřes mozku a před poraněním). Ke stanovení kvantitativních změn koncentrace těchto metabolitů bude použit nástroj Eretic v softwaru TopSpin 3.2. Tato kvantifikace koncentrace je založena na známé vnitřní koncentraci TSP v našich NMR vzorcích. Bude proveden Mann Whitney U test pro metabolickou analýzu a Fisherův exaktní test pro kategorická data.