Diagnóstico de concussão relacionada ao esporte usando metabólitos de urina

Fundo:

Concussão esportiva ou lesão cerebral traumática leve relacionada ao esporte (mTBI) afeta pacientes em todo o espectro de idade, raça e gênero. É um problema médico que, se não for tratado adequadamente, pode ter consequências devastadoras para pacientes e familiares. MTBI ou concussão (terminologia usada de forma intercambiável nesta proposta) mais recentemente tem sido um tema quente na mídia com políticos e atletas de alto perfil tendo resultados que alteram a carreira após uma concussão. De acordo com o Canadian Institute for Health Information, esportes e atividades recreativas foram a terceira principal causa de internações por TCE em hospitais canadenses em 2003-2004. Nos Estados Unidos, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças estima que 1,6 a 3,8 milhões de concussões ocorrem anualmente em atividades esportivas e recreativas. Em Calgary, aproximadamente 10.000 pacientes foram atendidos nos departamentos de emergência com traumatismo craniano em 2013, 80% dos quais foram diagnosticados como mTBI e a grande maioria deles relacionados ao esporte (dados não publicados).

Atualmente, não existe uma avaliação "padrão-ouro" ou marcador diagnóstico para determinar objetivamente se um paciente sofreu uma concussão esportiva e, em caso afirmativo, quanto tempo levará para se recuperar. Como tal, a concussão continua sendo um diagnóstico clínico baseado em sintomas pós-traumáticos, sinais físicos e comprometimento da função cognitiva, o que, na melhor das hipóteses, é feito por um profissional médico treinado e experiente. Mas, esta é principalmente uma abordagem qualitativa e individualizada para o diagnóstico e é tipicamente obscurecida pela falta de achados clínicos objetivos. Outras ferramentas de avaliação podem ajudar um clínico a diagnosticar uma concussão, como a Sport Concussion Assessment Tool 3 (SCAT3) (Apêndice 1), mas, infelizmente, isso não foi validado e foi desenvolvido com base no consenso de especialistas. Da mesma forma, testes neuropsicológicos computadorizados podem ajudar na avaliação da recuperação da concussão; no entanto, é caro, demorado e recentemente foi criticado por falta de especificidade e sensibilidade para traumatismo craniano.

Nos últimos 20 anos, os pesquisadores estudaram biomarcadores como S100B e enolase específica de neurônio na esperança de encontrar uma abordagem quantitativa para diagnosticar e prognosticar concussão. Infelizmente, isso gerou muita decepção, pois nenhum desses marcadores, por si só, tem especificidade ou sensibilidade adequada para ser usado como um único biomarcador na prática clínica.

Metabolômica é definida como "a medição quantitativa da resposta metabólica de sistemas vivos a estímulos fisiopatológicos ou modificação genética" e é baseada em plataformas analíticas como espectroscopia de ressonância magnética nuclear de prótons (1H NMR) e/ou espectrometria de massa. Estudos metabolômicos de biofluidos clinicamente acessíveis, como sangue e urina, fornecem um instantâneo intrincado e relativamente não invasivo dessa resposta. Até o momento, a metabolômica demonstrou ser uma ferramenta de biomarcador útil na esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal, câncer cerebral, esclerose múltipla, envelhecimento e doenças neurodegenerativas, epilepsia, acidente vascular cerebral, traumatismo cranioencefálico grave e doenças pediátricas. choque séptico. Até onde sabemos, nenhum estudo avaliou o perfil metabolômico quantitativo como uma ferramenta de diagnóstico e prognóstico em concussão esportiva.

Este estudo piloto ajudaria no seguinte:

1. Determinar a viabilidade de testar a metabolômica na população de concussão esportiva.
2. O primeiro estudo desse tipo a usar perfis metabólicos quantitativos para auxiliar no diagnóstico de concussão esportiva aguda.
3. O primeiro estudo desse tipo a desenvolver uma "impressão digital" metabólica que pode ajudar a prever a recuperação da concussão esportiva aguda.

Os indivíduos serão solicitados a fornecer uma amostra de urina de jato médio entre 7 e 9 da manhã antes da lesão e após a concussão. Alíquotas de urina serão obtidas imediatamente por centrifugação e armazenadas a -80C até serem necessárias para análise. Assim que todas as amostras forem coletadas, elas serão agrupadas e transportadas para a Universidade de Lethbridge para análise.

Nenhuma amostra para análise metabolômica passará por um ciclo prévio de congelamento/descongelamento. Uma alíquota de 450 μl será retirada de cada uma das amostras de urina e adicionada a 250 μl de solução tampão. A solução tampão será preparada com solução de fosfato de potássio a 0,5M e pH 7,4 ± 0,04. Esta solução tampão também contém 10 mL de azida sódica que atua como um agente antimicrobiano. O solvente para o tampão será 1 parte de D2O para 4 partes de água normal e o D2O contém 0,05 por cento em peso de ácido 3-(trimetilsilil)propiônico-2,2,3,3-d4 (TSP). A concentração final de TSP será utilizada como um desvio químico interno e padrão de quantificação. A solução tampão/urina é então centrifugada a 10 000 rpm por cinco minutos para remover qualquer material particulado, gorduras grandes ou proteínas grandes e 500 μl são pipetados para tubos de NMR de 5 mm.

Todos os espectros de RMN serão obtidos em um espectrômetro Bruker AVANCE III HD 700 MHz (Bruker BioSpin Ltd., Milton, ON, Canadá) equipado com uma plataforma de troca de amostra de alto rendimento, uma sonda de ressonância tripla (TBO) de 5 mm e software TopSpin 3.2. Cada amostra será adquirida usando a sequência de pulso de pré-saturação Bruker 1D padrão (noesygppr1d) com um tempo de mistura de 10 ms, um tempo de aquisição de 5 segundos, um atraso de reciclagem de 4 segundos e um total de 512 varreduras. Cada amostra será então processada com um alargamento de linha de 0,3 Hz.

Após o processamento inicial no TopSpin 3.2, todos os espectros serão carregados no matNMR (24), referenciados corretamente definindo o deslocamento TSP para 0 ppm e exportados para o espaço de trabalho Matlab ® para processamento posterior. Os espectros serão então agrupados usando um método dinâmico de classificação adaptativa (DAB) que foi codificado para o ambiente Matlab. Este método DAB lida com qualquer movimento nas linhas espectrais de um espectro para outro, que pode ser causado por uma pequena variação no pH de uma amostra para outra (pH = 7,4 ± 0,04) e garante que os picos do mesmo metabólito não sejam separados em diferentes bins. Após binning espectral, os espectros serão normalizados, com água e ureia excluídos da normalização, e escala de Pareto (26). Os espectros normalizados e dimensionados serão então analisados ​​usando análise de componentes principais (PCA) e análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA). O gráfico de carregamentos desses dois métodos será usado para identificar as caixas periféricas. O intervalo de mudança química associado a esses compartimentos periféricos será então comparado a uma biblioteca de metabólitos estabelecida para determinar quais metabólitos têm variação entre os grupos de comparação (concussão e pré-lesão). A ferramenta Eretic no software TopSpin 3.2 será utilizada para determinar as mudanças quantitativas na concentração desses metabólitos. Esta quantificação da concentração é baseada na concentração interna conhecida de TSP em nossas amostras de RMN. Um teste Mann Whitney U para análise metabólica e um teste exato de Fisher para os dados categóricos serão realizados.