上皮性卵巣腫瘍における Treg、Th17 細胞、NKT

勉強会。 研究グループは 60 人の女性で構成されていました。 患者は 3 つのサブグループに分けられました: 悪性上皮性卵巣腫瘍 (嚢胞腺癌) を持つ 24 人の女性、良性卵巣腫瘍 (嚢胞腺腫) を持つ 25 人の女性、および境界性卵巣腫瘍 (漿液性境界腫瘍) を持つ 11 人の女性のグループ。 対照群は、原因不明の不妊症の手術を受けた、卵巣の病状のない 20 人の女性で構成されていました。 患者は、2011 年から 2014 年の間に、ポーランドのルブリンにあるルブリン医科大学の第 2 婦人科に入院しました。 OC を有するすべての女性は、改訂された 2013 FIGO 分類 (International Journal of Gynecology and Obstetrics、2014 年 1 月) 末梢血からの単核細胞の分離 (PBMC) に従ってステージ III または IV でした。 肘前静脈から採取した直後に、比重1.077g / mlのGradisol L製剤（Aqua Medica、ウッチ、ポーランド）を20分間適用する密度勾配遠心分離により、単核細胞（PBMC）を分離しました。 700 × g で。 PBMC を含むペレットを PBS で 2 回洗浄し、数 (Neubauer チャンバーを使用) および生存率 (トリパン ブルー染色 - 0.4% トリパン ブルー ソリューション、Sigma-Aldrich、Munich、Germany) を評価しました。 95% 未満の生存率は不適格基準でした。

腫瘍および健康な組織に浸潤している単核細胞の分離。

手術中に、目に見える壊死領域を含まない卵巣組織 (サイズ約 1 cm3) が収集されました。 これをメスでみじん切りにし、30 ml の RPMI 1640 培地 (Biochrome、米国マサチューセッツ州ホリストン) に懸濁し、1 mg/ml コラゲナーゼ タイプ IA (Sigma-Aldrich、ミュンヘン、ドイツ)、1 mg/ml DNase タイプ I (Sigma-Aldrich、Munich、Germany)、0.1 mg/ml ヒアルロニダーゼ (Sigma-Aldrich、Munich、Germany) を 37°C で 60 分間、常にボルテックスします。 切断後、懸濁液をストレーナー（70μm、BD Biosciences、San Jose CA、USA）でろ過し、5分間遠心分離しました。 700 × g で。 懸濁細胞をRPMI 1640で2回洗浄した。

Th17 細胞の割合の評価。

末梢血単核細胞、健康な組織、および腫瘍組織の Th17 細胞 (IL-17A を分泌する) の割合の評価は、製造元の推奨 (eBiosciences、サンディエゴ、米国) に従って、Th17 サイトカイン染色パネルを使用したフローサイトメトリーによって行われました。 FACSCanto (BD Biosciences, San Jose CA, USA)。

PBMC培養および卵巣組織（腫瘍または対照）の確立およびイオノマイシンによる刺激。

ＰＢＭＣおよび卵巣組織の２４時間培養後、セットアップした。 培地は、2mM L-グルタミン、2% ヒトアルブミン (ZLB Bioplasma、ベルン、スイス) および 100 U/ml ペニシリン (Sigma -Aldrich、ミュンヘン、ドイツ) および 100 mg/ml ストレプトマイシン (Sigma-Aldrich、ミュンヘン、ドイツ)。 培養は、５ｍｌの培養培地中の６ウェルプレートで行った。 各患者について、PBMC の 1 つと、腫瘍細胞または正常な卵巣組織からの 2 つの培養物が確立されました。 培養は、標準条件（5% CO2、湿度 95%、37℃）のインキュベーターで 4 時間行った。 個々のウェルに以下を添加した：イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｕｎｉｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を濃度１μｇ／ｍｌで、ＰＭＡを濃度２５ｎｇ／ｍｌでサイトカインの産生のために細胞を刺激し、ブレフェルジンを濃度１０μｇ／ｍｌで加えた。 ml (Sigma-Aldrich、Munich、Germany) は小胞体の活性を阻害し、サイトカインを細胞内に保持します。

細胞内サイトカインの測定。

ボルテックス後、培養プレートから 2 つの適切に署名されたチューブに移動した後の 24 時間培養物を、2 ml のフローサイトメトリー染色バッファー (eBioscience、サンディエゴ、米国) で 2 回洗浄しました。 この手順の各すすぎで使用される一定のパラメーターは次のとおりです。実行時間 5 分、700 x g。 上清を除去した後、5μlの抗CD4（eFluor 450、eBioscience、サンディエゴ、米国）を各チューブに加えました。 混合物を２０分間インキュベートした。暗闇の中で。 洗い流した後、２ｍｌのフローサイトメトリー染色緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国サンディエゴ）中の過剰の抗体、１００μｌのＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国サンディエゴ）を各チューブに加えて固めた。 混合/ボルテックスし、この混合物も暗所で 20 分間インキュベートしました。 次いで、２ｍｌの透過処理緩衝液（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）で２回洗浄した。 緩衝液の調製には、PBS での 10 倍希釈が含まれていました。 上清を除去した後、細胞を100μlの透過化バッファーに再懸濁し、事前に準備したサイトメトリーチューブに分離して、対照サンプルと試験サンプルに分けました。 その後、5μlの抗体を試験サンプルに添加した：抗IL-17A (FITC)。 ボルテックスの後、すべてのサンプルを 20 分間インキュベートしました。暗闇の中で。 それらを2回洗浄し、フローサイトメトリー染色バッファーに細胞を懸濁した後、サイトメトリー分析を実施しました。 分析は、フローサイトメトリー BD FACSCanto II (BD Biosciences、サンディエゴ、米国) を使用して実行されました。 測定は、ソフトウェア BDFACS Diva を使用して実行されました。

制御性 T リンパ球の割合の推定。

末梢血単核細胞および健康組織と腫瘍組織における制御性 T リンパ球の割合の推定は、Human Treg Flow™ Kit (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE、BioLegend® 、米国）FACSCanto装置（BD Biosciences、サンディエゴ、米国）を使用して。

フローサイトメトリーによるiNKT細胞亜集団の決定

末梢血、健康な組織、および上皮性卵巣腫瘍から分離された単核細胞を、適切な量の適切なモノクローナル抗体 (メーカーが推奨する手順に従って) とともにインキュベートしました: 抗 iNKT FITC (抗 Vα24) (cat#558371 clone 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), anti-CD3 PE (Cat #554829, clone G4.18, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) および anti-CD161-PE f(clone Dx12, Cat# 550968, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)。 調製したサンプルを20分間インキュベートしました。 暗所で室温。 緩衝生理食塩水 (PBS) で 2 回洗浄した後、細胞を直ちにサイトメトリー分析にかけました。 データの取得と分析は、FACS Calibur フローサイトメーター (Becton Dickinson、ニュージャージー州、米国) を使用して実行されました。 発現細胞 iNKT+/CD3+/CD161+ は CD3+ の中で評価されました

タンパク質HE4、CA125およびアルゴリズムROMAの濃度の評価。

手術前に全患者からサンプルを採取し、3mlの血液を採取した。 血清を 2000 × g で遠心分離し、使用するまで -20 および -80°C で保存しました。 CA-125 および HE4 の血清レベルは、全自動化学発光分析装置 Cobs601 を使用して検出され、テスト手順は製造元 (Roche Diagnostics、Indianapolis、IN、USA) の指示に従って実行されました。 次に、卵巣癌リスク評価ソフトウェアの Roche ROMA インデックスを使用して、血清 HE4 および CA-125 レベルを ROMA インデックス値として計算しました。 血清 HE4 および CA-125 参照範囲は、それぞれ <140 pmol/l および <32 U/ml でした。

上皮性卵巣癌 (ROMA) のリスクの評価 ROMA インデックスは、HE4 および CA-125 のレベルに従って計算されました。 HE4 と CA-125 の量を卵巣がんリスク評価ソフトウェアに入力し、対応する ROMA インデックスを自動計算しました。 ROMA指数の閉経前の計算式は、12+2.38×LN(HE4)+0.062でした。 6 × LN(CA-125)。 ROMA指数の閉経後の計算式は、8.09+1.04でした。 × LN(HE4)+0.732 ×LN(CA-125)。 ROMA値が11.4以上の閉経前女性、 卵巣がんのリスクが高かった。 ROMA値が29.9以上の閉経後の女性は、卵巣がんのリスクが高かった。