Treg, células Th17, NKT no tumor epitelial do ovário

Grupos de estudo. O grupo de estudo consistiu de 60 mulheres. As pacientes foram divididas em 3 subgrupos: um grupo de 24 mulheres com tumores ovarianos epiteliais malignos (cistadenocarcinomas), 25 mulheres com tumores ovarianos benignos (cistadenomas) e 11 mulheres com tumores ovarianos borderline (tumores borderline serosos). O grupo controle consistiu de 20 mulheres sem patologia ovariana submetidas a cirurgia para infertilidade inexplicável. Os pacientes foram admitidos no IInd Department of Gynecology, Lublin Medical University, Lublin, Polônia, entre 2011 e 2014. Todas as mulheres com COs estavam em estágio III ou IV de acordo com a classificação FIGO revisada de 2013 (Jornal Internacional de Ginecologia e Obstetrícia, janeiro de 2014) Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Imediatamente após serem retiradas da veia antecubital, as células mononucleares (PBMCs) foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade aplicando a formulação Gradisol L de gravidade específica 1,077g/ml (Aqua Medica, Łódź, Polônia) por 20 min. a 700 x g. O pellet contendo PBMC foi lavado duas vezes em PBS e avaliado quanto ao número (usando câmara de Neubauer) e viabilidade (coloração com azul de tripano - 0,4% trypan Blue Solution, Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha). Viabilidade inferior a 95% foi um critério de desqualificação.

Isolamento de células mononucleares infiltrando o tumor e tecidos saudáveis.

Durante a cirurgia, foi coletado tecido ovariano (tamanho de aproximadamente 1cm3) sem áreas necróticas visíveis. Ele foi picado com bisturi, suspenso em 30 ml de meio RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, EUA) e submetido à clivagem em uma mistura contendo: 1 mg/ml de colagenase tipo IA (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha), 1 mg/ml de DNase tipo I (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha), 0,1 mg/ml de hialuronidase (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) a 37°C durante 60 min., constantemente agitado em vórtex. Após a clivagem, a suspensão foi filtrada através de um filtro (70μm, BD Biosciences, San Jose CA, EUA) e centrifugada por 5 min. a 700 x g. As células em suspensão foram lavadas duas vezes em RPMI 1640.

Avaliação da porcentagem de células Th17.

A avaliação da porcentagem de células Th17 (secretoras de IL-17A) de células mononucleares do sangue periférico, tecido saudável e tecido tumoral foi realizada por citometria de fluxo usando um painel Th17 Cytokine Staining de acordo com a recomendação do fabricante (eBiosciences, San Diego, EUA) usando a FACSCanto (BD Biosciences, San Jose CA, EUA).

Estabelecimento de cultura de PBMC e tecido ovariano (tumoral ou controle) e estimulação com ionomicina.

Após 24 horas, a cultura das PBMCs e tecido ovariano foi estabelecida. O meio foi preparado com 97% de RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, EUA) suplementado com 2mM de L-glutamina, 2% de albumina humana (ZLB Bioplasma, Berna, Suíça) e antibióticos na quantidade de 100 U/ml de penicilina (Sigma -Aldrich, Munique, Alemanha) e 100 mg/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha). O cultivo foi realizado em placas de 6 poços em meio de cultura de 5 ml. Para cada paciente, foram estabelecidas duas culturas, uma de PBMC e outra de células tumorais ou tecido ovariano normal. A cultura foi conduzida em incubadora sob condições padrão (5% CO2, 95% umidade, 37°C) por 4 horas. Aos poços individuais foram adicionados: ionomicina (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) na concentração de 1 ug/ml e PMA na concentração de 25 ng/ml para estimular as células para a produção de citocinas e brefeldina na concentração de 10 μg/ ml (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) a fim de inibir a atividade do retículo endoplasmático, levando à retenção da citocina no interior da célula.

A determinação de citocinas intracelulares.

As culturas de 24 horas após a transferência da placa de cultura para dois tubos devidamente assinados foram lavadas duas vezes em 2 ml de Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience, San Diego, EUA) após vórtex. Os parâmetros constantes usados ​​durante cada enxágue neste procedimento são: tempo de execução 5 min., 700 x g. Após a remoção do sobrenadante, 5μl de anti-CD4 (eFluor 450, eBioscience, San Diego, EUA) foram adicionados a cada tubo. A mistura foi incubada por 20 min. na escuridão. Após a lavagem, o excesso de anticorpo em 2 ml de Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience, San Diego, EUA), 100μl IC Fixation Buffer (eBioscience, San Diego, EUA) foi adicionado a cada tubo para consolidar. Misturar/Vortexar esta mistura também foi incubada por 20 minutos no escuro. Em seguida, foi lavado duas vezes com 2 ml do tampão de permeabilização (Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, EUA). A preparação do tampão envolveu sua diluição de 10 vezes com PBS. Após a remoção do sobrenadante, as células foram ressuspensas em 100μl de tampão de permeabilização e separadas para tubos de citometria previamente preparados em amostras de controle e teste. Em seguida, foram adicionados 5μl de anticorpos às amostras de teste: anti-IL-17A (FITC). Após o vórtex, todas as amostras foram incubadas por 20 min. na escuridão. Foram lavadas duas vezes e após suspensão das células no Flow Cytometry Staining Buffer, foi realizada a análise citométrica. A análise foi realizada usando citometria de fluxo BD FACSCanto II (BD Biosciences, San Diego, EUA). As medidas foram realizadas com o software BDFACS Diva.

Estimativa da porcentagem de linfócitos T reguladores.

A estimativa da porcentagem de linfócitos T reguladores entre as células mononucleares do sangue periférico e em tecido saudável e neoplásico foi feita pelo método de citometria de fluxo usando o Kit Human Treg Flow™ (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend® , EUA) com o uso do aparelho FACSCanto (BD Biosciences, San Diego, EUA).

Determinação da subpopulação de células iNKT por citometria de fluxo

Células mononucleares isoladas de sangue periférico, tecido saudável e tumores epiteliais de ovário foram incubadas com o volume apropriado (de acordo com os procedimentos recomendados pelos fabricantes) dos anticorpos monoclonais apropriados: o anti-iNKT FITC (anti-Vα24) (cat# 558371, clone 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA), anti-CD3 PE (Cat # 554829, clone G4. 18, BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA) e anti CD161-PE f (clone Dx12, Cat # 550968, BD Pharmingen, San Jose, CA, EUA). As amostras preparadas foram incubadas por 20 min. à temperatura ambiente no escuro. Após duas lavagens em solução salina fisiológica tamponada (PBS), as células foram imediatamente submetidas a análise citométrica. A aquisição e análise dos dados foram realizadas usando um citômetro de fluxo FACS Calibur (Becton Dickinson, New Jersey, EUA). As células que expressam iNKT+/CD3+/CD161+ foram classificadas entre CD3+

Avaliação da concentração da proteína HE4, CA125 e algoritmo ROMA.

Amostras foram coletadas de todos os pacientes antes da cirurgia e 3 ml de sangue foram coletados. O soro foi centrifugado a 2.000 × g e armazenado a -20 e -80°C até o uso. Os níveis séricos de CA-125 e HE4 foram detectados usando o analisador totalmente automático de quimioluminescência Cobs601 e o procedimento do teste foi realizado de acordo com as instruções do fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EUA). Em seguida, os níveis séricos de HE4 e CA-125 foram calculados para o valor do índice ROMA usando o índice Roche ROMA do software de avaliação de risco de câncer de ovário. O intervalo de referência sérico de HE4 e CA-125 foi <140 pmol/le <32 U/ml, respectivamente.

Avaliação do risco de carcinoma epitelial de ovário (ROMA) O índice ROMA foi calculado de acordo com os níveis de HE4 e CA-125. A quantidade de HE4 e CA-125 foi inserida no software de avaliação de risco de câncer de ovário, seguido pelo cálculo automático do índice ROMA correspondente. A fórmula de cálculo pré-menopausa do índice ROMA foi: 12+2,38 × LN(HE4)+0,062 6 × LN(CA-125). A fórmula de cálculo pós-menopausa do índice ROMA foi: 8,09+1,04 × LN(HE4)+0,732 × LN(CA-125). Mulheres na pré-menopausa com valor de ROMA ≥11,4, tinham maior risco de câncer de ovário. Mulheres pós-menopáusicas com valor de ROMA ≥29,9 tiveram maior risco de câncer de ovário.