Treg, cellule Th17, NKT nel tumore ovarico epiteliale

Gruppi di studio. Il gruppo di studio era composto da 60 donne. Le pazienti sono state suddivise in 3 sottogruppi: un gruppo di 24 donne con tumori ovarici epiteliali maligni (cistodenocarcinomi), 25 donne con tumori ovarici benigni (cistoadenomi) e 11 donne con tumori ovarici borderline (tumori borderline sierosi). Il gruppo di controllo era composto da 20 donne senza patologia ovarica che hanno subito un intervento chirurgico per infertilità inspiegabile. I pazienti sono stati ammessi al II° Dipartimento di Ginecologia, Lublin Medical University, Lublin, Polonia, tra il 2011 e il 2014. Tutte le donne con OC erano in stadio III o IV secondo la classificazione FIGO rivista del 2013 (International Journal of Gynecology and Obstetrics, gennaio 2014) Isolamento delle cellule mononucleate dal sangue periferico (PBMC). Immediatamente dopo essere state prelevate dalla vena antecubitale, le cellule mononucleari (PBMC) sono state isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità applicando la formulazione Gradisol L di peso specifico 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź, Polonia) per 20 minuti. a 700 x g. Il pellet contenente PBMC è stato lavato due volte in PBS e valutato per il numero (usando la camera di Neubauer) e la vitalità (colorazione blu tripan - Soluzione blu trypan 0,4%, Sigma-Aldrich, Monaco, Germania). La vitalità inferiore al 95% era un criterio di squalifica.

Isolamento delle cellule mononucleari infiltranti il ​​tumore e i tessuti sani.

Durante l'intervento è stato prelevato tessuto ovarico (dimensione di circa 1 cm3) che non conteneva aree necrotiche visibili. È stato tritato con un bisturi, sospeso in 30 ml di terreno RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, USA) e sottoposto a scissione in una miscela contenente: 1 mg/ml collagenasi di tipo IA (Sigma-Aldrich, Monaco, Germania), 1 mg/ml di DNasi di tipo I (Sigma-Aldrich, Monaco, Germania), 0,1 mg/ml di ialuronidasi (Sigma-Aldrich, Monaco, Germania) a 37°C per 60 min., costantemente vorticati. Dopo la scissione, la sospensione è stata filtrata attraverso un filtro (70 μm, BD Biosciences, San Jose CA, USA) e centrifugata per 5 minuti. a 700 x g. Le cellule in sospensione sono state lavate due volte in RPMI 1640.

Valutazione della percentuale di cellule Th17.

La valutazione della percentuale di cellule Th17 (che secernono IL-17A) di cellule mononucleate del sangue periferico, tessuto sano e tessuto tumorale è stata eseguita mediante citometria a flusso utilizzando un pannello di colorazione delle citochine Th17 secondo la raccomandazione del produttore (eBiosciences, San Diego, USA) utilizzando un FACSCanto (BD Biosciences, San Jose CA, USA).

Istituzione di coltura PBMC e tessuto ovarico (tumore o controllo) e stimolazione con ionomicina.

Dopo 24 ore è stata allestita la coltura delle PBMC e del tessuto ovarico. Il terreno è stato preparato costituito da 97% RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, USA) integrato con 2 mM di L-glutammina, 2% di albumina umana (ZLB Bioplasma, Berna, Svizzera) e antibiotici in una quantità di 100 U/ml di penicillina (Sigma -Aldrich, Monaco, Germania) e streptomicina 100 mg/ml (Sigma-Aldrich, Monaco, Germania). La coltura è stata effettuata in piastre da 6 pozzetti in un mezzo di coltura da 5 ml. Per ogni paziente sono state stabilite due colture, una di PBMC e l'altra di cellule tumorali o tessuto ovarico normale. La coltura è stata condotta in un incubatore in condizioni standard (5% CO2, 95% umidità, 37°C) per 4 ore. Ai singoli pozzetti sono stati aggiunti: ionomicina (Sigma-Aldrich, Monaco, Germania) alla concentrazione di 1 ug/ml e PMA alla concentrazione di 25 ng/ml per stimolare le cellule alla produzione di citochine e brefeldina alla concentrazione di 10 μg/ ml (Sigma-Aldrich, Monaco, Germania) al fine di inibire l'attività del reticolo endoplasmatico, portando a trattenere la citochina all'interno della cellula.

La determinazione delle citochine intracellulari.

Le colture di 24 ore dopo il passaggio dalla piastra di coltura a due provette correttamente firmate sono state lavate due volte in 2 ml di tampone di colorazione per citometria a flusso (eBioscience, San Diego, USA) dopo il vortex. I parametri costanti utilizzati durante ogni risciacquo in questa procedura sono: tempo di esecuzione 5 min., 700 x g. Dopo aver rimosso il surnatante, a ciascuna provetta sono stati aggiunti 5 μl di anti-CD4 (eFluor 450, eBioscience, San Diego, USA). La miscela è stata incubata per 20 min. nell'oscurità. Dopo il lavaggio, l'eccesso di anticorpo in 2 ml di Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience, San Diego, USA), 100 μl di tampone di fissazione IC (eBioscience, San Diego, USA) è stato aggiunto a ciascuna provetta per consolidare. Miscelazione/agitazione su vortex anche questa miscela è stata incubata per 20 minuti al buio. Quindi è stato lavato due volte con 2 ml del tampone di permeabilizzazione (Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, USA). La preparazione del tampone ha comportato la sua diluizione 10 volte con PBS. Dopo aver rimosso il supernatante, le cellule sono state risospese in 100 μl di tampone di permeabilizzazione e separate in provette per citometria precedentemente preparate in campioni di controllo e test. Successivamente, ai campioni del test sono stati aggiunti 5 μl di anticorpi: anti-IL-17A (FITC). Dopo il vortex, tutti i campioni sono stati incubati per 20 min. nell'oscurità. Sono stati lavati due volte e dopo aver sospeso le cellule nel tampone di colorazione per citometria a flusso, è stata eseguita l'analisi citometrica. L'analisi è stata eseguita utilizzando la citometria a flusso BD FACSCanto II (BD Biosciences, San Diego, USA). Le misurazioni sono state eseguite utilizzando il software BDFACS Diva.

Stima della percentuale di linfociti T regolatori.

La stima della percentuale di linfociti T regolatori tra le cellule mononucleate del sangue periferico e nel tessuto sano e neoplastico è stata effettuata con il metodo della citometria a flusso utilizzando il kit Human Treg Flow™ (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend® , USA) con l'uso dell'apparato FACSCanto (BD Biosciences, San Diego, USA).

Determinazione della sottopopolazione di cellule iNKT mediante citometria a flusso

Cellule mononucleate isolate da sangue periferico, tessuto sano e tumori ovarici epiteliali sono state incubate con il volume appropriato (secondo le procedure raccomandate dai produttori) degli anticorpi monoclonali appropriati: l'anti-iNKT FITC (anti-Vα24) (cat#558371, clone 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), anti-CD3 PE (Cat #554829, clone G4. 18, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) e anti CD161-PE f(clone Dx12, Cat# 550968, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). I campioni preparati sono stati incubati per 20 min. a temperatura ambiente al buio. Dopo due lavaggi in soluzione fisiologica tamponata (PBS), le cellule sono state immediatamente sottoposte ad analisi citometriche. L'acquisizione e l'analisi dei dati sono state eseguite utilizzando un citometro a flusso FACS Calibur (Becton Dickinson, New Jersey, USA). Le cellule che esprimono iNKT+/CD3+/CD161+ sono state classificate tra CD3+

Valutazione della concentrazione della proteina HE4, CA125 e algoritmo ROMA.

I campioni sono stati raccolti da tutti i pazienti prima dell'intervento chirurgico e sono stati raccolti 3 ml di sangue. Il siero è stato centrifugato a 2000 × g e conservato a -20 e -80°C fino all'uso. I livelli sierici di CA-125 e HE4 sono stati rilevati utilizzando l'analizzatore a chemiluminescenza completamente automatico Cobs601 e la procedura di test è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Successivamente, i livelli sierici di HE4 e CA-125 sono stati calcolati per il valore dell'indice ROMA utilizzando l'indice Roche ROMA del software di valutazione del rischio di cancro ovarico. L'intervallo di riferimento sierico di HE4 e CA-125 era rispettivamente <140 pmol/l e <32 U/ml.

Valutazione del rischio di carcinoma ovarico epiteliale (ROMA) L'indice ROMA è stato calcolato in base ai livelli di HE4 e CA-125. La quantità di HE4 e CA-125 è stata inserita nel software di valutazione del rischio di cancro ovarico, seguita dal calcolo automatico dell'indice ROMA corrispondente. La formula di calcolo dell'indice ROMA in premenopausa era: 12+2,38 × LN(HE4)+0,062 6×LN(CA-125). La formula di calcolo postmenopausale dell'indice ROMA era: 8.09+1.04 × LN(HE4)+0,732 ×LN(CA-125). Donne in premenopausa con un valore ROMA ≥11,4, aveva un rischio più elevato di cancro alle ovaie. Le donne in postmenopausa con valore ROMA ≥29,9 avevano un rischio più elevato di cancro ovarico.