Treg, Th17 celler, NKT i epitelial ovarietumor

Studiegrupper. Studiegruppen bestod af 60 kvinder. Patienterne blev opdelt i 3 undergrupper: en gruppe på 24 kvinder med maligne epiteliale ovarietumorer (cystadenocarcinomer), 25 kvinder med godartede ovarietumorer (cystadenomer) og 11 kvinder med borderline ovarietumorer (serøse borderline tumorer). Kontrolgruppen bestod af 20 kvinder uden ovariepatologi, som blev opereret for uforklarlig infertilitet. Patienter blev indlagt på anden afdeling for gynækologi, Lublin Medical University, Lublin, Polen, mellem 2011 og 2014. Alle kvinder med OC'er blev stadie III eller IV i henhold til revideret 2013 FIGO klassifikation (International Journal of Gynecology and Obstetrics, januar, 2014) Isolering af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er). Umiddelbart efter at være blevet taget fra den antecubitale vene, blev mononukleære celler (PBMC'er) isoleret ved tæthedsgradientcentrifugering ved anvendelse af Gradisol L-formulering med specifik vægt 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź, Polen) i 20 min. ved 700 x g. Pelleten indeholdende PBMC blev vasket to gange i PBS og evalueret for antallet (ved anvendelse af Neubauer-kammer) og levedygtighed (trypanblåt farvning - 0,4% trypanblåt opløsning, Sigma-Aldrich, München, Tyskland). Levedygtighed på mindre end 95 % var et diskvalificerende kriterium.

Isolering af mononukleære celler, der infiltrerer tumoren og sundt væv.

Under operationen blev ovarievæv (størrelse på ca. 1 cm3), der ikke indeholdt nogen synlige nekrotiske områder, opsamlet. Det blev hakket med en skalpel, suspenderet i 30 ml RPMI 1640 medium (Biochrome, Holliston MA, USA) og underkastet spaltning i en blanding indeholdende: 1 mg/ml collagenase type IA (Sigma-Aldrich, München, Tyskland), 1 mg/ml DNase type I (Sigma-Aldrich, München, Tyskland), 0,1 mg/ml hyaluronidase (Sigma-Aldrich, München, Tyskland) ved 37°C i 60 min., vortex konstant. Efter spaltning blev suspensionen filtreret gennem en si (70μm, BD Biosciences, San Jose CA, USA) og centrifugeret i 5 min. ved 700 x g. Suspensionscellerne blev vasket to gange i RPMI 1640.

Evaluering af procentdelen af ​​Th17-celler.

Evalueringen af ​​procentdelen af ​​Th17-celler (udskiller IL-17A) af mononukleære celler fra perifert blod, sundt væv og tumorvæv blev udført ved flowcytometri under anvendelse af et Th17 Cytokine-farvningspanel i henhold til producentens anbefaling (eBiosciences, San Diego, USA) vha. en FACSCanto (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Etablering af PBMC-kultur og ovarievæv (tumor eller kontrol) og stimulering med ionomycin.

Efter 24-timers dyrkning af PBMC'erne og ovarievæv blev sat op. Mediet blev fremstillet bestående af 97% RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, USA) suppleret med 2mM L-glutamin, 2% humant albumin (ZLB Bioplasma, Bern, Schweiz) og antibiotika i en mængde på 100 U/ml penicillin (Sigma) -Aldrich, München, Tyskland) og 100 mg/ml streptomycin (Sigma-Aldrich, München, Tyskland). Dyrkning blev udført i 6-brønds plader i et 5 ml dyrkningsmedium. For hver patient blev der etableret to kulturer, den ene af PBMC og den anden fra tumorceller eller normalt ovarievæv. Kulturen blev udført i en inkubator under standardbetingelser (5% CO2, 95% fugtighed, 37°C) i 4 timer. Til individuelle brønde blev tilsat: ionomycin (Sigma-Aldrich, München, Tyskland) i en koncentration på 1 ug/ml og PMA i en koncentration på 25 ng/ml for at stimulere celler til produktion af cytokiner og brefeldin i en koncentration på 10 μg/ ml (Sigma-Aldrich, München, Tyskland) for at hæmme aktiviteten af ​​det endoplasmatiske retikulum, hvilket fører til at tilbageholde cytokinet i cellen.

Bestemmelse af intracellulære cytokiner.

24-timers kulturer efter flytning fra dyrkningspladen til to korrekt signerede rør blev vasket to gange i 2 ml Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience, San Diego, USA) efter vortexing. Konstante parametre, der bruges under hver skylning i denne procedure, er: køretid 5 min., 700 x g. Efter fjernelse af supernatanten blev 5 μl anti-CD4 (eFluor 450, eBioscience, San Diego, USA) tilsat til hvert rør. Blandingen blev inkuberet i 20 min. i mørke. Efter vask blev overskuddet af antistof i 2 ml Flow Cytometri Staining Buffer (eBioscience, San Diego, USA), 100μl IC Fixation Buffer (eBioscience, San Diego, USA) tilsat til hvert rør for at konsolidere. Blanding/hvirvelblanding blev denne blanding også inkuberet i 20 minutter i mørke. Derefter blev det vasket to gange med 2 ml af permeabiliseringsbufferen (Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, USA). Fremstilling af bufferen involverede dens 10 gange fortynding med PBS. Efter fjernelse af supernatanten blev cellerne resuspenderet i 100 μl permeabiliseringsbuffer og adskilt til tidligere forberedte cytometrirør i kontrol- og testprøver. Derefter blev der tilsat 5μl antistoffer til testprøverne: anti-IL-17A (FITC). Efter vortexing blev alle prøver inkuberet i 20 min. i mørke. De blev vasket to gange, og efter suspendering af cellerne i flowcytometri-farvningsbufferen blev der udført cytometrisk analyse. Analyse blev udført under anvendelse af flowcytometrisk BD FACSCanto II (BD Biosciences, San Diego, USA). Målinger blev udført ved hjælp af softwaren BDFACS Diva.

Estimering af procentdelen af ​​regulatoriske T-lymfocytter.

Estimering af procentdelen af ​​regulatoriske T-lymfocytter blandt mononukleære celler i perifert blod og i sundt og neoplastisk væv blev foretaget med flowcytometrimetoden ved hjælp af Human Treg Flow™ Kit (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend® , USA) med brug af FACSCanto-apparater (BD Biosciences, San Diego, USA).

Bestemmelse af iNKT-cellesubpopulation ved flowcytometri

Mononukleære celler isoleret fra perifert blod, sundt væv og epiteliale ovarietumorer blev inkuberet med det passende volumen (i henhold til procedurerne anbefalet af producenterne) af de passende monoklonale antistoffer: anti-iNKT FITC (anti-Vα24) (kat#558371, klon 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), anti-CD3 PE (kat #554829, klon G4. 18, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) og anti CD161-PE f(klon Dx12, kat # 550968, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). Forberedte prøver blev inkuberet i 20 min. ved stuetemperatur i mørke. Efter to gange vask i bufret fysiologisk saltvand (PBS) blev cellerne straks underkastet cytometrisk analyse. Dataopsamling og analyse blev udført under anvendelse af et FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, New Jersey, USA). Udtrykkende celler iNKT+/CD3+/CD161+ blev bedømt blandt CD3+

Vurdering af koncentration af protein HE4, CA125 og algoritme ROMA.

Prøver blev indsamlet fra alle patienterne før operationen, og 3 ml blod blev opsamlet. Serum blev centrifugeret ved 2000 x g og opbevaret ved -20 og -80°C indtil brug. Serumniveauer af CA-125 og HE4 blev påvist under anvendelse af den fuldautomatiske kemiluminescensanalysator Cobs601, og testproceduren blev udført i henhold til producentens instruktioner (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Dernæst blev serum-HE4- og CA-125-niveauer beregnet for ROMA-indeksværdi ved hjælp af Roche ROMA-indekset for ovariecancerrisikovurderingssoftware. Serum HE4 og CA-125 referenceområde var henholdsvis <140 pmol/l og <32 U/ml.

Vurdering af risiko for epiteliale ovariecarcinom (ROMA) ROMA-indekset blev beregnet i henhold til niveauerne af HE4 og CA-125. HE4 og CA-125 mængde blev input til ovariecancer risikovurderingssoftware, efterfulgt af automatisk beregning af det tilsvarende ROMA indeks. Den præmenopausale beregningsformel for ROMA-indekset var: 12+2,38 × LN(HE4)+0,062 6 x LN(CA-125). Den postmenopausale beregningsformel for ROMA-indekset var: 8,09+1,04 x LN(HE4)+0,732 x LN(CA-125). Præmenopausale kvinder med en ROMA-værdi ≥11,4, havde en højere risiko for kræft i æggestokkene. Postmenopausale kvinder med ROMA-værdi ≥29,9 havde en højere risiko for ovariecancer.