Treg, Th17-Zellen, NKT bei epithelialem Ovarialtumor

Studiengruppen. Die Studiengruppe bestand aus 60 Frauen. Die Patientinnen wurden in 3 Untergruppen eingeteilt: eine Gruppe von 24 Frauen mit bösartigen epithelialen Ovarialtumoren (Cystadenokarzinome), 25 Frauen mit gutartigen Ovarialtumoren (Cystadenome) und 11 Frauen mit Borderline-Ovarialtumoren (seröse Borderline-Tumoren). Die Kontrollgruppe bestand aus 20 Frauen ohne ovarielle Pathologie, die wegen ungeklärter Unfruchtbarkeit operiert wurden. Die Patientinnen wurden zwischen 2011 und 2014 an der II. Abteilung für Gynäkologie der Medizinischen Universität Lublin, Lublin, Polen, aufgenommen. Alle Frauen mit OCs wurden gemäß der überarbeiteten FIGO-Klassifikation von 2013 (International Journal of Gynecology and Obstetrics, Januar 2014) Isolierung mononukleärer Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) in Stadium III oder IV eingestuft. Unmittelbar nach der Entnahme aus der Antekubitalvene wurden mononukleäre Zellen (PBMCs) durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung einer Gradisol L-Formulierung mit einem spezifischen Gewicht von 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź, Polen) für 20 Minuten isoliert. bei 700 x g. Das PBMC enthaltende Pellet wurde zweimal in PBS gewaschen und auf Anzahl (unter Verwendung der Neubauer-Kammer) und Lebensfähigkeit (Trypanblau-Färbung – 0,4 % Trypanblau-Lösung, Sigma-Aldrich, München, Deutschland) bewertet. Eine Lebensfähigkeit von weniger als 95 % war ein Ausschlusskriterium.

Isolierung mononukleärer Zellen, die den Tumor und gesundes Gewebe infiltrieren.

Während der Operation wurde Eierstockgewebe (Größe ca. 1 cm3) entnommen, das keine sichtbaren nekrotischen Bereiche enthielt. Es wurde mit einem Skalpell zerkleinert, in 30 ml RPMI 1640-Medium (Biochrome, Holliston MA, USA) suspendiert und einer Spaltung in einem Gemisch unterzogen, das enthielt: 1 mg/ml Collagenase Typ IA (Sigma-Aldrich, München, Deutschland), 1 mg/ml DNase Typ I (Sigma-Aldrich, München, Deutschland), 0,1 mg/ml Hyaluronidase (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) bei 37°C für 60 min, konstant gevortext. Nach der Spaltung wurde die Suspension durch ein Sieb (70 μm, BD Biosciences, San Jose CA, USA) filtriert und 5 min zentrifugiert. bei 700 x g. Die Suspensionszellen wurden zweimal in RPMI 1640 gewaschen.

Auswertung des Prozentsatzes an Th17-Zellen.

Die Auswertung des Prozentsatzes an Th17-Zellen (IL-17A sezernierend) von peripheren mononukleären Blutzellen, gesundem Gewebe und Tumorgewebe wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines Th17-Zytokin-Färbepanels gemäß der Empfehlung des Herstellers (eBiosciences, San Diego, USA) durchgeführt aFACSCanto (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Etablierung von PBMC-Kultur und Eierstockgewebe (Tumor oder Kontrolle) und Stimulation mit Ionomycin.

Nach 24 Stunden wurde eine Kultur der PBMCs und Eierstockgewebe angelegt. Das Medium wurde hergestellt, bestehend aus 97 % RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, USA), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 2 % Humanalbumin (ZLB Bioplasma, Bern, Schweiz) und Antibiotika in einer Menge von 100 U/ml Penicillin (Sigma -Aldrich, München, Deutschland) und 100 mg/ml Streptomycin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland). Die Kultivierung erfolgte in 6-Well-Platten in 5 ml Kulturmedium. Für jede Patientin wurden zwei Kulturen angelegt, eine von den PBMC und die andere von Tumorzellen oder normalem Eierstockgewebe. Die Kultur wurde in einem Inkubator unter Standardbedingungen (5 % CO 2 , 95 % Feuchtigkeit, 37 °C) für 4 Stunden durchgeführt. Zu einzelnen Vertiefungen wurden hinzugefügt: Ionomycin (Sigma-Aldrich, München, Deutschland) in einer Konzentration von 1 ug/ml und PMA in einer Konzentration von 25 ng/ml, um die Zellen zur Produktion von Zytokinen und Brefeldin in einer Konzentration von 10 ug/ml zu stimulieren. ml (Sigma-Aldrich, München, Deutschland), um die Aktivität des endoplasmatischen Retikulums zu hemmen, was dazu führt, dass das Zytokin in der Zelle zurückgehalten wird.

Die Bestimmung von intrazellulären Zytokinen.

24-Stunden-Kulturen nach dem Bewegen von der Kulturplatte in zwei ordnungsgemäß gekennzeichnete Röhrchen wurden nach dem Vortexen zweimal in 2 ml Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience, San Diego, USA) gewaschen. Konstante Parameter, die während jeder Spülung in diesem Verfahren verwendet werden, sind: Laufzeit 5 min, 700 x g. Nach Entfernen des Überstands wurden jedem Röhrchen 5 μl Anti-CD4 (eFluor 450, eBioscience, San Diego, USA) zugesetzt. Die Mischung wurde für 20 min inkubiert. in der Dunkelheit. Nach dem Wegwaschen wurde der Überschuss an Antikörper in 2 ml Durchflusszytometrie-Färbepuffer (eBioscience, San Diego, USA), 100 &mgr;l IC-Fixierungspuffer (eBioscience, San Diego, USA) zu jedem Röhrchen hinzugefügt, um zu konsolidieren. Mischen/Verwirbeln Diese Mischung wurde auch für 20 Minuten im Dunkeln inkubiert. Dann wurde zweimal mit 2 ml des Permeabilisierungspuffers (Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, USA) gewaschen. Die Herstellung des Puffers beinhaltete seine 10-fache Verdünnung mit PBS. Nach Entfernen des Überstands wurden die Zellen in 100 &mgr;l Permeabilisierungspuffer resuspendiert und in zuvor vorbereiteten Zytometrieröhrchen in Kontroll- und Testproben getrennt. Danach wurden den Testproben 5 μl Antikörper zugesetzt: Anti-IL-17A (FITC). Nach dem Vortexen wurden alle Proben für 20 min inkubiert. in der Dunkelheit. Sie wurden zweimal gewaschen und nach dem Suspendieren der Zellen in dem Durchflusszytometrie-Färbepuffer wurde eine zytometrische Analyse durchgeführt. Die Analyse wurde unter Verwendung von durchflusszytometrischem BD FACSCanto II (BD Biosciences, San Diego, USA) durchgeführt. Die Messungen wurden mit der Software BDFACS Diva durchgeführt.

Schätzung des Prozentsatzes regulatorischer T-Lymphozyten.

Die Abschätzung des Prozentsatzes regulatorischer T-Lymphozyten in peripheren mononukleären Blutzellen und in gesundem und neoplastischem Gewebe wurde mit der Durchflusszytometriemethode unter Verwendung des Human Treg Flow™ Kits (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend® , USA) unter Verwendung eines FACSCanto-Apparats (BD Biosciences, San Diego, USA).

Bestimmung der iNKT-Zellsubpopulation durch Durchflusszytometrie

Aus peripherem Blut, gesundem Gewebe und epithelialen Eierstocktumoren isolierte mononukleäre Zellen wurden mit dem geeigneten Volumen (gemäß den von den Herstellern empfohlenen Verfahren) der geeigneten monoklonalen Antikörper inkubiert: dem Anti-iNKT FITC (Anti-Vα24) (Kat.-Nr. 558371, Klon 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), Anti-CD3 PE (Kat.-Nr. 554829, Klon G4.18, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) und Anti-CD161-PE f (Klon Dx12, Kat.-Nr. 550968, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). Vorbereitete Proben wurden für 20 min inkubiert. bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach zweimaligem Waschen in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) wurden die Zellen sofort einer zytometrischen Analyse unterzogen. Die Datenerfassung und -analyse wurde unter Verwendung eines FACS Calibur-Durchflusszytometers (Becton Dickinson, New Jersey, USA) durchgeführt. Exprimierende Zellen iNKT+/CD3+/CD161+ wurden unter CD3+ eingestuft

Bewertung der Konzentration von Protein HE4, CA125 und Algorithmus ROMA.

Proben wurden von allen Patienten vor der Operation gesammelt und 3 ml Blut wurden gesammelt. Das Serum wurde bei 2000 × g zentrifugiert und bis zur Verwendung bei –20 und –80°C gelagert. Die Serumspiegel von CA-125 und HE4 wurden unter Verwendung des vollautomatischen Chemilumineszenz-Analysators Cobs601 nachgewiesen, und das Testverfahren wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Als nächstes wurden die HE4- und CA-125-Spiegel im Serum für den ROMA-Indexwert unter Verwendung des Roche ROMA-Index der Risikobewertungssoftware für Eierstockkrebs berechnet. Serum-HE4- und -CA-125-Referenzbereiche waren < 140 pmol/l bzw. < 32 U/ml.

Bewertung des Risikos für epitheliales Ovarialkarzinom (ROMA) Der ROMA-Index wurde anhand der Spiegel von HE4 und CA-125 berechnet. Die HE4- und CA-125-Menge wurde in die Risikobewertungssoftware für Eierstockkrebs eingegeben, gefolgt von einer automatischen Berechnung des entsprechenden ROMA-Index. Die prämenopausale Berechnungsformel des ROMA-Index lautete: 12+2,38 × LN(HE4)+0,062 6 × LN(CA-125). Die postmenopausale Berechnungsformel des ROMA-Index lautete: 8,09+1,04 × LN(HE4)+0,732 × LN(CA-125). Prämenopausale Frauen mit einem ROMA-Wert ≥11,4, hatte ein höheres Risiko für Eierstockkrebs. Postmenopausale Frauen mit einem ROMA-Wert ≥29,9 hatten ein höheres Risiko für Eierstockkrebs.