Treg, komórki Th17, NKT w nabłonkowym guzie jajnika

Grupy badawcze. Grupa badana składała się z 60 kobiet. Pacjentki podzielono na 3 podgrupy: grupę 24 kobiet ze złośliwymi nabłonkowymi guzami jajnika (cystadenocarcinoma), 25 kobiet z łagodnymi guzami jajnika (cystadenoma) oraz 11 kobiet z rakiem jajnika o granicznej złośliwości (surowicze guzy graniczne). Grupę kontrolną stanowiło 20 kobiet bez patologii jajników, które przeszły operację z powodu niewyjaśnionej niepłodności. Pacjentki były przyjmowane do II Kliniki Ginekologii Lubelskiego Uniwersytetu Medycznego w Lublinie w latach 2011-2014. Wszystkie kobiety z OC zostały zakwalifikowane do III lub IV stopnia zgodnie z poprawioną klasyfikacją FIGO z 2013 r. (International Journal of Gynecology and Obstetrics, styczeń 2014 r.) Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej (PBMC). Bezpośrednio po pobraniu z żyły łokciowej komórki jednojądrzaste (PBMC) izolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości, stosując preparat Gradisol L o ciężarze właściwym 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź, Polska) przez 20 min. przy 700 x g. Osad zawierający PBMC przemyto dwukrotnie w PBS i oceniono pod względem liczby (stosując komorę Neubauera) i żywotności (barwienie błękitem trypanu - 0,4% roztwór błękitu trypanu, Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy). Kryterium dyskwalifikującym była żywotność poniżej 95%.

Izolacja komórek jednojądrzastych naciekających guz i zdrowe tkanki.

Podczas zabiegu pobrano tkankę jajnika (o objętości około 1 cm3) nie zawierającą widocznych obszarów martwiczych. Zmielono go skalpelem, zawieszono w 30 ml pożywki RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, USA) i poddano cięciu w mieszaninie zawierającej: 1 mg/ml kolagenazy typu IA (Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy), 1 mg/ml DNazy typu I (Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy), 0,1 mg/ml hialuronidazy (Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy) w 37°C przez 60 min., stale worteksować. Po rozszczepieniu zawiesinę przesączono przez filtr siatkowy (70 μm, BD Biosciences, San Jose CA, USA) i wirowano przez 5 minut. przy 700 x g. Zawiesinę komórek przemyto dwukrotnie w RPMI 1640.

Ocena odsetka komórek Th17.

Ocenę odsetka komórek Th17 (wydzielających IL-17A) komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, tkanki zdrowej i tkanki nowotworowej przeprowadzono metodą cytometrii przepływowej z użyciem panelu Th17 Cytokine Staining zgodnie z zaleceniami producenta (eBiosciences, San Diego, USA) przy użyciu a FACSCanto (BD Biosciences, San Jose CA, USA).

Założenie kultury PBMC i tkanki jajnika (guza lub kontrola) i stymulacja jonomycyną.

Po 24 godzinach założono hodowlę PBMC i tkanki jajnika. Przygotowano pożywkę zawierającą 97% RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, USA) uzupełnioną 2 mM L-glutaminą, 2% albuminą ludzką (ZLB Bioplasma, Bern, Szwajcaria) i antybiotykami w ilości 100 U/ml penicyliny (Sigma -Aldrich, Monachium, Niemcy) i 100 mg/ml streptomycyny (Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy). Hodowlę prowadzono w 6-studzienkowych płytkach w 5 ml pożywki hodowlanej. Dla każdego pacjenta ustalono dwie hodowle, jedną z PBMC, a drugą z komórek nowotworowych lub normalnej tkanki jajnika. Hodowlę prowadzono w inkubatorze w standardowych warunkach (5% CO2, 95% wilgotności, 37°C) przez 4 godziny. Do poszczególnych studzienek dodano: jonomycynę (Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy) w stężeniu 1 μg/ml oraz PMA w stężeniu 25 ng/ml w celu stymulacji komórek do produkcji cytokin oraz brefeldynę w stężeniu 10 μg/ml ml (Sigma-Aldrich, Monachium, Niemcy) w celu zahamowania aktywności retikulum endoplazmatycznego, co prowadzi do zatrzymania cytokiny w komórce.

Oznaczanie cytokin wewnątrzkomórkowych.

24-godzinne hodowle po przeniesieniu z płytki hodowlanej do dwóch prawidłowo podpisanych probówek przemyto dwukrotnie w 2 ml buforu do cytometrii przepływowej Staining Buffer (eBioscience, San Diego, USA) po worteksowaniu. Stałe parametry stosowane podczas każdego płukania w tej procedurze to: czas przebiegu 5 min., 700 x g. Po usunięciu supernatantu do każdej probówki dodano 5 μl anty-CD4 (eFluor 450, eBioscience, San Diego, USA). Mieszaninę inkubowano przez 20 min. w ciemności. Po wypłukaniu do każdej probówki dodano nadmiar przeciwciała w 2 ml buforu barwiącego do cytometrii przepływowej (eBioscience, San Diego, USA), 100 μl buforu utrwalającego IC (eBioscience, San Diego, USA) w celu konsolidacji. Mieszanie/wytrząsanie tę mieszaninę również inkubowano przez 20 minut w ciemności. Następnie przemyto ją dwukrotnie 2 ml buforu permeabilizacji (Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, USA). Przygotowanie buforu polegało na jego 10-krotnym rozcieńczeniu PBS. Po usunięciu supernatantu komórki ponownie zawieszono w 100 μl buforu permeabilizującego i rozdzielono do wcześniej przygotowanych probówek cytometrycznych na próbki kontrolne i testowe. Następnie do badanych próbek dodano 5 μl przeciwciał: anty-IL-17A (FITC). Po worteksowaniu wszystkie próbki inkubowano przez 20 min. w ciemności. Płukano je dwukrotnie i po zawieszeniu komórek w buforze do barwienia cytometrii przepływowej przeprowadzono analizę cytometryczną. Analizę przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej BD FACSCanto II (BD Biosciences, San Diego, USA). Pomiary wykonano za pomocą oprogramowania BDFACS Diva.

Oszacowanie odsetka regulatorowych limfocytów T.

Oceny odsetka regulatorowych limfocytów T wśród jednojądrzastych komórek krwi obwodowej oraz w tkance zdrowej i nowotworowej dokonano metodą cytometrii przepływowej z użyciem zestawu Human Treg Flow™ Kit (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend® , USA) przy użyciu aparatu FACSCanto (BD Biosciences, San Diego, USA).

Określenie subpopulacji komórek iNKT za pomocą cytometrii przepływowej

Komórki jednojądrzaste wyizolowane z krwi obwodowej, zdrowych tkanek i nabłonkowych guzów jajnika inkubowano z odpowiednią objętością (zgodnie z procedurami zalecanymi przez producentów) odpowiednich przeciwciał monoklonalnych: anty-iNKT FITC (anty-Vα24) (nr kat. 558371, klon 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), anty-CD3 PE (nr kat. 554829, klon G4.18, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) i anty-CD161-PE f (klon Dx12, nr kat. 550968, BD Pharmingen, San Jose, Kalifornia, USA). Przygotowane próbki inkubowano przez 20 min. w temperaturze pokojowej w ciemności. Po dwukrotnym przemyciu buforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) komórki natychmiast poddano analizie cytometrycznej. Akwizycję i analizę danych przeprowadzono przy użyciu cytometru przepływowego FACS Calibur (Becton Dickinson, New Jersey, USA). Komórki wykazujące ekspresję iNKT+/CD3+/CD161+ zostały sklasyfikowane jako CD3+

Ocena stężenia białka HE4, CA125 i algorytmu ROMA.

Od wszystkich pacjentów pobrano próbki przed operacją i pobrano 3 ml krwi. Surowicę odwirowano przy 2000 x gi przechowywano w temperaturze -20 i -80°C do czasu użycia. Poziomy CA-125 i HE4 w surowicy oznaczano za pomocą w pełni automatycznego analizatora chemiluminescencyjnego Cobs601, a procedurę testową przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Następnie obliczono poziomy HE4 i CA-125 w surowicy dla wartości wskaźnika ROMA przy użyciu wskaźnika Roche ROMA oprogramowania do oceny ryzyka raka jajnika. Zakresy referencyjne dla HE4 i CA-125 w surowicy wynosiły odpowiednio <140 pmol/l i <32 U/ml.

Ocena ryzyka zachorowania na nabłonkowego raka jajnika (ROMA) Wskaźnik ROMA obliczono na podstawie poziomów HE4 i CA-125. Ilość HE4 i CA-125 została wprowadzona do oprogramowania do oceny ryzyka raka jajnika, po czym nastąpiło automatyczne obliczenie odpowiedniego wskaźnika ROMA. Przedmenopauzalny wzór obliczeniowy wskaźnika ROMA był następujący: 12+2,38 × LN(HE4)+0,062 6 × LN (CA-125). Postmenopauzalny wzór obliczeniowy wskaźnika ROMA wynosił: 8,09+1,04 × LN(HE4)+0,732 × LN(CA-125). kobiety przed menopauzą z wartością ROMA ≥11,4, była bardziej narażona na raka jajnika. Kobiety po menopauzie z wartością ROMA ≥29,9 miały większe ryzyko raka jajnika.