Treg, Th17 buňky, NKT v epiteliálním ovariálním nádoru

Studijní skupiny. Studijní skupinu tvořilo 60 žen. Pacientky byly rozděleny do 3 podskupin: skupina 24 žen s maligními epiteliálními nádory vaječníků (cystadenokarcinomy), 25 žen s benigními nádory vaječníků (cystadenomy) a 11 žen s hraničními nádory vaječníků (serózní hraniční nádory). Kontrolní skupinu tvořilo 20 žen bez ovariální patologie, které podstoupily operaci pro nevysvětlitelnou neplodnost. Pacientky byly přijaty na II. gynekologickou kliniku, Lublin Medical University, Lublin, Polsko, v letech 2011 až 2014. Všechny ženy s OK byly zařazeny do stádia III nebo IV podle revidované klasifikace FIGO z roku 2013 (International Journal of Gynecology and Obstetrics, leden, 2014). Izolace mononukleárních buněk z periferní krve (PBMC). Ihned po odebrání z antekubitální žíly byly mononukleární buňky (PBMC) izolovány centrifugací v hustotním gradientu s použitím přípravku Gradisol L o specifické hmotnosti 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź, Polsko) po dobu 20 minut. na 700 x g. Peleta obsahující PBMC byla dvakrát promyta v PBS a vyhodnocena na počet (za použití Neubauerovy komory) a životaschopnost (barvení trypanovou modří - 0,4% roztok trypanové modři, Sigma-Aldrich, Mnichov, Německo). Životaschopnost nižší než 95 % byla diskvalifikačním kritériem.

Izolace mononukleárních buněk infiltrujících nádor a zdravé tkáně.

Během operace byla odebrána ovariální tkáň (velikost přibližně 1 cm3), která neobsahovala žádné viditelné nekrotické oblasti. Byl rozemlet skalpelem, suspendován ve 30 ml média RPMI 1640 (Biochrom, Holliston MA, USA) a podroben štěpení ve směsi obsahující: 1 mg/ml kolagenázy typu IA (Sigma-Aldrich, Mnichov, Německo), 1 mg/ml DNázy typu I (Sigma-Aldrich, Mnichov, Německo), 0,1 mg/ml hyaluronidázy (Sigma-Aldrich, Mnichov, Německo) při 37 °C po dobu 60 minut, neustále vortexováno. Po štěpení byla suspenze zfiltrována přes sítko (70μm, BD Biosciences, San Jose CA, USA) a centrifugována 5 min. na 700 x g. Suspenze buněk byla dvakrát promyta v RPMI 1640.

Vyhodnocení procenta buněk Th17.

Vyhodnocení procenta buněk Th17 (sekretujících IL-17A) mononukleárních buněk periferní krve, zdravé tkáně a nádorové tkáně bylo provedeno průtokovou cytometrií pomocí panelu Th17 Cytokine Stained podle doporučení výrobce (eBiosciences, San Diego, USA) za použití FACSCanto (BD Biosciences, San Jose CA, USA).

Založení kultury PBMC a ovariální tkáně (nádor nebo kontrola) a stimulace ionomycinem.

Po 24-hodinové kultivaci PBMC a ovariální tkáně byly připraveny. Bylo připraveno médium skládající se z 97 % RPMI 1640 (Biochrom, Holliston MA, USA) doplněného 2 mM L-glutaminem, 2 % lidským albuminem (ZLB Bioplasma, Bern, Švýcarsko) a antibiotiky v množství 100 U/ml penicilinu (Sigma -Aldrich, Mnichov, Německo) a 100 mg/ml streptomycinu (Sigma-Aldrich, Mnichov, Německo). Kultivace byla prováděna v 6-jamkových destičkách v 5 ml kultivačního média. Pro každého pacienta byly založeny dvě kultury, jedna z PBMC a druhá z nádorových buněk nebo normální ovariální tkáně. Kultivace byla prováděna v inkubátoru za standardních podmínek (5 % C02, 95 % vlhkost, 37 °C) po dobu 4 hodin. Do jednotlivých jamek byly přidány: ionomycin (Sigma-Aldrich, Mnichov, Německo) v koncentraci 1 ug/ml a PMA v koncentraci 25 ng/ml pro stimulaci buněk pro produkci cytokinů a brefeldinu v koncentraci 10 μg/ ml (Sigma-Aldrich, Mnichov, Německo), aby se inhibovala aktivita endoplazmatického retikula, což vede k zadržení cytokinu v buňce.

Stanovení intracelulárních cytokinů.

24hodinové kultury po přesunu z kultivační plotny do dvou řádně označených zkumavek byly po promíchání dvakrát promyty ve 2 ml pufru pro barvení průtokové cytometrie (eBioscience, San Diego, USA). Konstantní parametry používané při každém oplachování v tomto postupu jsou: doba chodu 5 min., 700 x g. Po odstranění supernatantu bylo do každé zkumavky přidáno 5 μl anti-CD4 (eFluor 450, eBioscience, San Diego, USA). Směs byla inkubována po dobu 20 minut. v temnotě. Po promytí byl do každé zkumavky přidán přebytek protilátky ve 2 ml barvícího pufru průtokové cytometrie (eBioscience, San Diego, USA), 100 μl IC fixačního pufru (eBioscience, San Diego, USA), aby došlo ke konsolidaci. Míchání/vortexování tato směs byla také inkubována po dobu 20 minut ve tmě. Poté byla dvakrát promyta 2 ml permeabilizačního pufru (Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, USA). Příprava pufru zahrnovala jeho 10násobné zředění PBS. Po odstranění supernatantu byly buňky resuspendovány ve 100 μl permeabilizačního pufru a rozděleny do předem připravených cytometrických zkumavek na kontrolní a testovací vzorky. Poté bylo k testovaným vzorkům přidáno 5 μl protilátek: anti-IL-17A (FITC). Po vortexování byly všechny vzorky inkubovány po dobu 20 minut. v temnotě. Byly dvakrát promyty a po suspendování buněk v pufru pro barvení průtokové cytometrie byla provedena cytometrická analýza. Analýza byla provedena pomocí průtokové cytometrie BD FACSCanto II (BD Biosciences, San Diego, USA). Měření byla provedena pomocí softwaru BDFACS Diva.

Odhad procenta regulačních T lymfocytů.

Odhad procenta regulačních T lymfocytů mezi mononukleárními buňkami periferní krve a ve zdravé a neoplastické tkáni byl proveden metodou průtokové cytometrie za použití sady Human Treg Flow™ (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend® , USA) s použitím přístroje FACSCanto (BD Biosciences, San Diego, USA).

Stanovení subpopulace buněk iNKT průtokovou cytometrií

Mononukleární buňky izolované z periferní krve, zdravé tkáně a epiteliálních nádorů vaječníků byly inkubovány s příslušným objemem (podle postupů doporučených výrobci) příslušných monoklonálních protilátek: anti-iNKT FITC (anti-Vα24) (kat#558371, klon 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), anti-CD3 PE (kat. č. 554829, klon G4. 18, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) a anti CD161-PE f(klon Dx12, kat. č. 550968, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). Připravené vzorky byly inkubovány po dobu 20 minut. při pokojové teplotě ve tmě. Po dvojnásobném promytí v pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) byly buňky okamžitě podrobeny cytometrické analýze. Získávání dat a analýza byly prováděny pomocí průtokového cytometru FACS Calibur (Becton Dickinson, New Jersey, USA). Exprimující buňky iNKT+/CD3+/CD161+ byly hodnoceny jako CD3+

Stanovení koncentrace proteinu HE4, CA125 a algoritmus ROMA.

Od všech pacientů byly odebrány vzorky před operací a byly odebrány 3 ml krve. Sérum bylo centrifugováno při 2000 x g a skladováno při -20 a -80 °C až do použití. Sérové ​​hladiny CA-125 a HE4 byly detekovány pomocí plně automatického chemiluminiscenčního analyzátoru Cobs601 a testovací postup byl proveden podle pokynů výrobce (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Dále byly vypočteny hladiny HE4 a CA-125 v séru pro hodnotu indexu ROMA pomocí indexu Roche ROMA softwaru pro hodnocení rizika rakoviny vaječníků. Referenční rozmezí sérové ​​HE4 a CA-125 bylo <140 pmol/la <32 U/ml, v daném pořadí.

Hodnocení rizika epiteliálního ovariálního karcinomu (ROMA) Index ROMA byl vypočten podle hladin HE4 a CA-125. Množství HE4 a CA-125 bylo zadáno do softwaru pro hodnocení rizika rakoviny vaječníků, po kterém následoval automatický výpočet odpovídajícího indexu ROMA. Vzorec pro premenopauzální výpočet indexu ROMA byl: 12+2,38 × LN(HE4)+0,062 6 x LN(CA-125). Vzorec pro výpočet indexu ROMA po menopauze byl: 8,09+1,04 × LN(HE4)+0,732 x LN(CA-125). Premenopauzální ženy s hodnotou ROMA ≥ 11,4, měli vyšší riziko rakoviny vaječníků. Postmenopauzální ženy s hodnotou ROMA ≥29,9 měly vyšší riziko rakoviny vaječníků.