상피성 난소 종양의 Treg, Th17 세포, NKT

스터디 그룹. 연구 그룹은 60명의 여성으로 구성되었습니다. 환자들은 악성 상피성 난소 종양(낭선암종)이 있는 여성 24명, 양성 난소 종양(낭선종)이 있는 여성 25명, 경계성 난소 종양(장액성 경계성 종양)이 있는 여성 11명의 3개 하위 그룹으로 분류되었습니다. 대조군은 원인 불명의 불임으로 수술을 받은 난소 병리가 없는 20명의 여성으로 구성되었습니다. 환자들은 2011년에서 2014년 사이에 폴란드 루블린에 있는 루블린 의과 대학 산부인과에 입원했습니다. OC가 있는 모든 여성은 수정된 2013 FIGO 분류(International Journal of Gynecology and Obstetrics, January, 2014) Isolation of mononuclear cell from peripheral blood(PBMCs)에 따라 III기 또는 IV기였습니다. 전주 정맥에서 채취한 직후, 단핵 세포(PBMC)를 비중 1.077g/ml의 Gradisol L 제형(Aqua Medica, Łódź, 폴란드)을 적용하여 20분 동안 밀도 구배 원심분리에 의해 분리하였다. 700 x g에서. PBMC를 포함하는 펠릿을 PBS에서 2회 세척하고 수(Neubauer 챔버 사용) 및 생존력(트리판 블루 염색 - 0.4% 트리판 블루 용액, Sigma-Aldrich, 독일 뮌헨)에 대해 평가하였다. 95% 미만의 생존율은 실격 기준이었습니다.

종양 및 건강한 조직에 침윤하는 단핵 세포의 분리.

수술 중 육안으로 보이는 괴사 부위가 없는 난소 조직(크기 약 1cm3)을 채취하였다. 그것은 메스로 다지고 30 ml의 RPMI 1640 배지(Biochrome, Holliston MA, USA)에 현탁하고 다음을 함유하는 혼합물에서 절단하였다: 1 mg/ml 콜라게나제 유형 IA(Sigma-Aldrich, Munich, Germany), 1 mg/ml DNase I형(Sigma-Aldrich, Munich, Germany), 0.1 mg/ml hyaluronidase(Sigma-Aldrich, Munich, Germany), 37°C에서 60분 동안, 지속적으로 와동. 절단 후, 현탁액을 스트레이너(70μm, BD Biosciences, San Jose CA, USA)를 통해 여과하고 5분 동안 원심분리하였다. 700 x g에서. 현탁 세포를 RPMI 1640에서 2회 세척하였다.

Th17 세포의 백분율 평가.

말초 혈액 단핵 세포, 건강한 조직 및 종양 조직의 Th17 세포(IL-17A 분비)의 백분율 평가는 제조사의 권장 사항(eBiosciences, San Diego, USA)에 따라 Th17 Cytokine Staining 패널을 사용하여 유세포 분석법으로 수행했습니다. FACSCanto (BD Biosciences, San Jose CA,USA).

PBMC 배양 및 난소 조직(종양 또는 대조군) 확립 및 이오노마이신으로 자극.

24시간 배양 후 PBMC와 난소 조직을 설정했습니다. 배지는 2mM L-글루타민, 2% 인간 알부민(ZLB Bioplasma, Bern, Switzerland) 및 100 U/ml 페니실린(Sigma -Aldrich, 독일 뮌헨) 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(Sigma-Aldrich, 독일 뮌헨). 배양은 5 ml 배양 배지에서 6-웰 플레이트에서 수행하였다. 각 환자에 대해 PBMC 중 하나와 종양 세포 또는 정상 난소 조직에서 얻은 두 가지 배양액을 확립했습니다. 배양은 표준 조건(5% CO2, 95% 습도, 37℃)의 인큐베이터에서 4시간 동안 수행하였다. 개별 웰에 다음을 첨가하였다: 1 ug/ml 농도의 이오노마이신(Sigma-Aldrich, Munich, Germany) 및 25 ng/ml 농도의 PMA를 첨가하여 사이토카인 및 10 μg/ml 농도의 브레펠딘 생산을 위한 세포 자극 ml (Sigma-Aldrich, Munich, Germany)는 소포체의 활동을 억제하여 세포 내에서 사이토카인을 유지하도록 합니다.

세포내 사이토카인의 결정.

배양 플레이트에서 2개의 적절하게 서명된 튜브로 이동한 후 24시간 배양을 vortexing 후 Flow Cytometry Staining Buffer(eBioscience, San Diego, USA) 2ml에서 두 번 세척했습니다. 이 절차에서 각 헹굼 동안 사용되는 상수 매개변수는 실행 시간 5분, 700 x g입니다. 상등액을 제거한 후 항-CD4(eFluor 450, eBioscience, San Diego, USA) 5μl를 각 튜브에 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 인큐베이션하였다. 어둠 속에서. 세척 후, 유세포 분석 염색 완충액(eBioscience, San Diego, USA) 2ml, IC 고정 완충액(eBioscience, San Diego, USA) 100μl 중 과량의 항체를 각 튜브에 첨가하여 통합시켰다. 혼합/볼텍싱 이 혼합물을 암실에서 20분 동안 배양했습니다. 그런 다음 투과 완충액(Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, USA) 2ml로 2회 세척하였다. 버퍼 준비에는 PBS로 10배 희석이 포함되었습니다. 상청액을 제거한 후 세포를 100μl의 투과 완충액에 재현탁하고 미리 준비한 세포 분석 튜브에 분리하여 대조군과 시험 시료로 분리했습니다. 그 후, 5μl 항체를 시험 샘플에 첨가하였다: 항-IL-17A(FITC). 볼텍싱 후, 모든 샘플을 20분 동안 인큐베이션하였다. 어둠 속에서. 이를 두 번 세척하고 세포를 Flow Cytometry Staining Buffer에 현탁한 후 세포 측정 분석을 수행했습니다. 유세포 분석 BD FACSCanto II(BD Biosciences, San Diego, USA)를 사용하여 분석을 수행했습니다. 소프트웨어 BDFACS Diva를 사용하여 측정을 수행했습니다.

조절 T 림프구의 백분율 추정.

Human Treg Flow™ Kit(FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend® , USA) FACSCanto 장치(BD Biosciences, San Diego, USA)를 사용하여.

유동 세포 계측법에 의한 iNKT 세포 하위 집단의 결정

말초 혈액, 건강한 조직 및 상피 난소 종양에서 분리된 단핵 세포는 적절한 단클론 항체의 적절한 부피(제조업체가 권장하는 절차에 따름)와 함께 배양되었습니다: 항-iNKT FITC(항-Vα24)(cat#558371, 클론 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), 항-CD3 PE(Cat #554829, clone G4.18, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) 및 항 CD161-PE f(clone Dx12, Cat# 550968, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). 준비된 샘플을 20분 동안 배양하였다. 어둠 속에서 실온에서. 완충 생리 식염수(PBS)에서 두 번 세척한 후 세포를 즉시 세포 측정 분석에 적용했습니다. FACS Calibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, New Jersey, USA)를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행했습니다. 발현 세포 iNKT+/CD3+/CD161+는 CD3+

단백질 HE4, CA125 및 알고리즘 ROMA의 농도 평가.

수술 전 모든 환자로부터 샘플을 채취하고 3ml의 혈액을 채취했습니다. 혈청을 2000 x g에서 원심분리하고 사용할 때까지 -20 및 -80°C에서 보관했습니다. CA-125 및 HE4의 혈청 수준은 전자동 화학발광 분석기 Cobs601을 사용하여 검출되었고 시험 절차는 제조업체의 지침(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)에 따라 수행되었습니다. 다음으로, 혈청 HE4 및 CA-125 수준은 난소암 위험 평가 소프트웨어의 Roche ROMA 지수를 사용하여 ROMA 지수 값에 대해 계산되었습니다. 혈청 HE4 및 CA-125 참조 범위는 각각 <140 pmol/l 및 <32 U/ml였습니다.

상피성 난소암(ROMA)의 위험도 평가 ROMA 지수는 HE4 및 CA-125의 수준에 따라 계산되었습니다. HE4 및 CA-125 양을 난소암 위험 평가 소프트웨어에 입력한 후 해당 ROMA 지수를 자동으로 계산했습니다. ROMA 지수의 폐경 전 계산 공식은 다음과 같습니다. 12+2.38 × LN(HE4)+0.062 6 × LN(CA-125). ROMA 지수의 폐경기 계산식은 다음과 같습니다. 8.09+1.04 × LN(HE4)+0.732 × LN(CA-125). ROMA 값이 11.4 이상인 폐경 전 여성, 난소암의 위험이 더 높았습니다. ROMA 값이 29.9 이상인 폐경 후 여성은 난소암 위험이 더 높았습니다.