Treg, células Th17, NKT en tumor epitelial de ovario

Grupos de estudio. El grupo de estudio estuvo formado por 60 mujeres. Las pacientes se dividieron en 3 subgrupos: un grupo de 24 mujeres con tumores ováricos epiteliales malignos (cistoadenocarcinomas), 25 mujeres con tumores ováricos benignos (cistoadenomas) y 11 mujeres con tumores ováricos borderline (tumores borderline serosos). El grupo de control consistió en 20 mujeres sin patología ovárica que se sometieron a cirugía por infertilidad inexplicable. Los pacientes ingresaron en el II Departamento de Ginecología de la Universidad Médica de Lublin, Lublin, Polonia, entre 2011 y 2014. Todas las mujeres con OC se clasificaron en etapas III o IV de acuerdo con la clasificación FIGO revisada de 2013 (International Journal of Gynecology and Obstetrics, enero de 2014) Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Inmediatamente después de ser extraídas de la vena antecubital, las células mononucleares (PBMC) se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad aplicando la formulación Gradisol L de gravedad específica 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź, Polonia) durante 20 min. a 700 x g. El sedimento que contenía PBMC se lavó dos veces en PBS y se evaluó el número (usando una cámara de Neubauer) y la viabilidad (tinción con azul de tripano - solución de azul de tripano al 0,4 %, Sigma-Aldrich, Munich, Alemania). La viabilidad de menos del 95% fue un criterio de descalificación.

Aislamiento de células mononucleares infiltrantes en el tumor y tejidos sanos.

Durante la cirugía, se recogió tejido ovárico (tamaño de aproximadamente 1 cm3) que no contenía áreas necróticas visibles. Se picó con bisturí, se suspendió en 30 ml de medio RPMI 1640 (Biochrome, Holliston MA, EE. UU.) y se sometió a escisión en una mezcla que contenía: 1 mg/ml de colagenasa tipo IA (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania), 1 mg/ml de DNasa tipo I (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania), 0,1 mg/ml de hialuronidasa (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) a 37°C durante 60 min., agitado constantemente. Después de la escisión, la suspensión se filtró a través de un filtro (70 μm, BD Biosciences, San Jose CA, EE. UU.) y se centrifugó durante 5 min. a 700 x g. Las células en suspensión se lavaron dos veces en RPMI 1640.

Evaluación del porcentaje de células Th17.

La evaluación del porcentaje de células Th17 (secretoras de IL-17A) de células mononucleares de sangre periférica, tejido sano y tejido tumoral se realizó mediante citometría de flujo utilizando un panel Th17 Cytokine Staining según recomendación del fabricante (eBiosciences, San Diego, EE. UU.) utilizando a FACSCanto (BD Biosciences, San José CA, EE. UU.).

Establecimiento de cultivo de PBMC y tejido ovárico (tumor o control) y estimulación con ionomicina.

Después de 24 horas, se preparó el cultivo de las PBMC y el tejido ovárico. El medio se preparó con RPMI 1640 al 97 % (Biochrome, Holliston MA, EE. UU.) suplementado con L-glutamina 2 mM, albúmina humana al 2 % (ZLB Bioplasma, Berna, Suiza) y antibióticos en una cantidad de 100 U/ml de penicilina (Sigma -Aldrich, Munich, Alemania) y estreptomicina 100 mg/ml (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania). El cultivo se llevó a cabo en placas de 6 pozos en un medio de cultivo de 5 ml. Para cada paciente se establecieron dos cultivos, uno de las PBMC y otro de células tumorales o tejido ovárico normal. El cultivo se llevó a cabo en una incubadora en condiciones estándar (5 % de CO2, 95 % de humedad, 37 °C) durante 4 horas. A los pocillos individuales se les añadió: ionomicina (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) a una concentración de 1 ug/ml y PMA a una concentración de 25 ng/ml para estimular las células para la producción de citoquinas y brefeldina a una concentración de 10 μg/ ml (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) con el fin de inhibir la actividad del retículo endoplásmico, lo que lleva a retener la citoquina dentro de la célula.

La determinación de citoquinas intracelulares.

Los cultivos de 24 horas después de pasar de la placa de cultivo a dos tubos debidamente firmados se lavaron dos veces en 2 ml de tampón de tinción de citometría de flujo (eBioscience, San Diego, EE. UU.) después de agitar en vórtex. Los parámetros constantes utilizados durante cada enjuague en este procedimiento son: tiempo de ejecución 5 min., 700 x g. Después de retirar el sobrenadante, se añadieron a cada tubo 5 μl de anti-CD4 (eFluor 450, eBioscience, San Diego, EE. UU.). La mezcla se incubó durante 20 min. en la oscuridad. Después de lavar, se añadió a cada tubo el exceso de anticuerpo en 2 ml de tampón de tinción de citometría de flujo (eBioscience, San Diego, EE. UU.), 100 μl de tampón de fijación IC (eBioscience, San Diego, EE. UU.) para consolidar. Mezclado/agitación vorticial Esta mezcla también se incubó durante 20 minutos en la oscuridad. Luego se lavó dos veces con 2 ml del buffer de permeabilización (Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, USA). La preparación del tampón implicó su dilución de 10 veces con PBS. Después de eliminar el sobrenadante, las células se resuspendieron en 100 μl de tampón de permeabilización y se separaron en tubos de citometría preparados previamente en muestras de control y de prueba. A continuación, se añadieron 5 μl de anticuerpos a las muestras de ensayo: anti-IL-17A (FITC). Después de agitar, todas las muestras se incubaron durante 20 min. en la oscuridad. Se lavaron dos veces y después de suspender las células en el tampón de tinción de citometría de flujo, se realizó el análisis citométrico. El análisis se realizó mediante citometría de flujo BD FACSCanto II (BD Biosciences, San Diego, EE. UU.). Las mediciones se realizaron utilizando el software BDFACS Diva.

Estimación del porcentaje de linfocitos T reguladores.

La estimación del porcentaje de linfocitos T reguladores entre células mononucleares de sangre periférica y en tejido sano y neoplásico se realizó con el método de citometría de flujo utilizando el Human Treg Flow™ Kit (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend® , USA) con el uso del aparato FACSCanto (BD Biosciences, San Diego, USA).

Determinación de la subpoblación de células iNKT por citometría de flujo

Se incubaron células mononucleares aisladas de sangre periférica, tejido sano y tumores epiteliales de ovario con el volumen adecuado (de acuerdo con los procedimientos recomendados por los fabricantes) de los anticuerpos monoclonales apropiados: el anti-iNKT FITC (anti-Vα24) (cat#558371, clon 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, EE. UU.), anti-CD3 PE (N.° de cat. 554829, clon G4. 18, BD Pharmingen, San Jose, CA, EE. UU.) y anti-CD161-PE f (clon Dx12, N.° de cat. 550968, BD Pharmingen, San José, CA, EE. UU.). Las muestras preparadas se incubaron durante 20 min. a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar dos veces en solución salina fisiológica tamponada (PBS), las células se sometieron inmediatamente a análisis citométrico. La adquisición y el análisis de datos se realizaron utilizando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, Nueva Jersey, EE. UU.). Las células que expresan iNKT+/CD3+/CD161+ se clasificaron entre CD3+

Valoración de concentración de proteína HE4, CA125 y algoritmo ROMA.

Se recogieron muestras de todos los pacientes antes de la cirugía y se recogieron 3 ml de sangre. El suero se centrifugó a 2000 × g y se almacenó a -20 y -80 °C hasta su uso. El nivel sérico de CA-125 y HE4 se detectó utilizando el analizador de quimioluminiscencia completamente automático Cobs601 y el procedimiento de prueba se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE. UU.). A continuación, se calcularon los niveles séricos de HE4 y CA-125 para el valor del índice ROMA utilizando el índice Roche ROMA del software de evaluación de riesgo de cáncer de ovario. El rango de referencia de HE4 y CA-125 en suero fue <140 pmol/l y <32 U/ml, respectivamente.

Evaluación del riesgo de carcinoma epitelial de ovario (ROMA) El índice ROMA se calculó según los niveles de HE4 y CA-125. La cantidad de HE4 y CA-125 se ingresó al software de evaluación de riesgo de cáncer de ovario, seguido del cálculo automático del índice ROMA correspondiente. La fórmula de cálculo premenopáusica del índice ROMA fue: 12+2,38 × LN(HE4)+0,062 6 × LN(CA-125). La fórmula de cálculo posmenopáusica del índice ROMA fue: 8.09+1.04 × LN(HE4)+0.732 × LN(CA-125). Mujeres premenopáusicas con un valor de ROMA ≥11.4, tenía un mayor riesgo de cáncer de ovario. Las mujeres posmenopáusicas con valor ROMA ≥29,9 tenían mayor riesgo de cáncer de ovario.