Treg, Th17-solut, NKT epiteelin munasarjakasvaimessa

Opintoryhmät. Tutkimusryhmässä oli 60 naista. Potilaat jaettiin 3 alaryhmään: 24 naisen ryhmä, joilla oli pahanlaatuisia epiteelin munasarjojen kasvaimia (kystadenokarsinoomat), 25 naisella, joilla oli hyvänlaatuisia munasarjakasvaimia (kystadenoomia) ja 11 naisella, joilla oli rajalliset munasarjakasvaimet (seroiset rajatuumorit). Kontrolliryhmä koostui 20 naisesta, joilla ei ollut munasarjapatologiaa ja joille tehtiin leikkaus selittämättömän hedelmättömyyden vuoksi. Potilaat otettiin toisen gynekologian osastolle, Lublin Medical University, Lublin, Puola, vuosina 2011–2014. Kaikki OC:t sairastavat naiset sijoitettiin III- tai IV-vaiheeseen vuoden 2013 tarkistetun FIGO-luokituksen mukaan (International Journal of Gynecology and Obstetrics, tammikuu, 2014). Yksitumaisten solujen eristäminen ääreisverestä (PBMC). Välittömästi kyynärpäälaskimosta ottamisen jälkeen mononukleaariset solut (PBMC:t) eristettiin tiheysgradienttisentrifugoinnilla käyttämällä Gradisol L -formulaatiota, jonka ominaispaino oli 1,077 g/ml (Aqua Medica, Łódź, Puola) 20 minuutin ajan. 700 x g. PBMC:tä sisältävä pelletti pestiin kahdesti PBS:ssä ja arvioitiin lukumäärän (käyttäen Neubauer-kammiota) ja elinkelpoisuuden (trypaanisininen värjäys - 0,4 % trypan Blue Solution, Sigma-Aldrich, München, Saksa) suhteen. Alle 95 %:n elinkelpoisuus oli hylkäyskriteeri.

Kasvaimeen ja terveisiin kudoksiin tunkeutuvien mononukleaaristen solujen eristäminen.

Leikkauksen aikana kerättiin munasarjakudosta (koko noin 1 cm3), joka ei sisältänyt näkyviä nekroottisia alueita. Se jauhettiin skalpellilla, suspendoitiin 30 ml:aan RPMI 1640 -alustaa (Biochrome, Holliston MA, USA) ja pilkottiin seoksessa, joka sisälsi: 1 mg/ml kollagenaasityyppiä IA (Sigma-Aldrich, München, Saksa), 1 mg/ml DNaasi tyyppi I (Sigma-Aldrich, München, Saksa), 0,1 mg/ml hyaluronidaasi (Sigma-Aldrich, München, Saksa) 37 °C:ssa 60 minuuttia, jatkuvasti vorteksoitava. Pilkkomisen jälkeen suspensio suodatettiin siivilän läpi (70 μm, BD Biosciences, San Jose CA, USA) ja sentrifugoitiin 5 minuuttia. 700 x g. Suspensiosolut pestiin kahdesti RPMI 1640:ssä.

Th17-solujen prosenttiosuuden arviointi.

Th17-solujen (erittävät IL-17A:ta) prosenttiosuuden arviointi perifeerisen veren mononukleaarisista soluista, terveistä kudoksista ja kasvainkudoksesta suoritettiin virtaussytometrialla käyttäen Th17 Cytokine Staining -paneelia valmistajan suosituksen mukaisesti (eBiosciences, San Diego, USA) käyttäen FACSCanto (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

PBMC-viljelmän ja munasarjakudoksen (kasvain tai kontrolli) perustaminen ja stimulaatio ionomysiinillä.

PBMC:iden ja munasarjakudoksen viljely perustettiin 24 tunnin jälkeen. Elatusaine valmistettiin sisältäen 97 % RPMI 1640:tä (Biochrome, Holliston MA, USA), jota oli täydennetty 2 mM L-glutamiinilla, 2 % ihmisen albumiinilla (ZLB Bioplasma, Bern, Sveitsi) ja antibiooteilla 100 U/ml penisilliiniä (Sigma) -Aldrich, München, Saksa) ja 100 mg/ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich, München, Saksa). Viljely suoritettiin 6-kuoppaisilla levyillä 5 ml:n elatusaineessa. Kullekin potilaalle perustettiin kaksi viljelmää, yksi PBMC:stä ja toinen kasvainsoluista tai normaalista munasarjakudoksesta. Viljely suoritettiin inkubaattorissa standardiolosuhteissa (5 % C02, 95 % kosteus, 37 °C) 4 tunnin ajan. Yksittäisiin kuoppiin lisättiin: ionomysiiniä (Sigma-Aldrich, München, Saksa) pitoisuutena 1 ug/ml ja PMA:ta pitoisuutena 25 ng/ml solujen stimuloimiseksi sytokiinien ja brefeldiinin tuotantoon pitoisuutena 10 µg/ml. ml (Sigma-Aldrich, München, Saksa) endoplasmisen retikulumin toiminnan estämiseksi, mikä johtaa sytokiinin säilyttämiseen solussa.

Solunsisäisten sytokiinien määritys.

24 tunnin viljelmät viljelylevyltä kahteen oikein merkittyyn putkeen siirtämisen jälkeen pestiin kahdesti 2 ml:ssa Flow Cytometry Staining Bufferia (eBioscience, San Diego, USA) vorteksoinnin jälkeen. Tässä menettelyssä jokaisen huuhtelun aikana käytetyt vakioparametrit ovat: ajoaika 5 min., 700 x g. Supernatantin poistamisen jälkeen jokaiseen putkeen lisättiin 5 μl anti-CD4:ää (eFluor 450, eBioscience, San Diego, USA). Seosta inkuboitiin 20 minuuttia. pimeässä. Pesun jälkeen jokaiseen putkeen lisättiin ylimäärä vasta-ainetta 2 ml:ssa Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience, San Diego, USA) ja 100 µl IC Fixation Buffer (eBioscience, San Diego, USA) tiivistämiseksi. Sekoittamalla/vorteksoimalla tätä seosta inkuboitiin myös 20 minuuttia pimeässä. Sitten se pestiin kahdesti 2 ml:lla permeabilisaatiopuskuria (Permeabilization Buffer, eBioscience, San Diego, USA). Puskurin valmistaminen sisälsi sen 10-kertaisen laimentamisen PBS:llä. Supernatantin poistamisen jälkeen solut suspendoitiin uudelleen 100 µl:aan permeabilisaatiopuskuria ja erotettiin aiemmin valmistettuihin sytometriaputkiin kontrolli- ja testinäytteiksi. Sen jälkeen testinäytteisiin lisättiin 5 µl vasta-aineita: anti-IL-17A (FITC). Vorteksoinnin jälkeen kaikkia näytteitä inkuboitiin 20 minuuttia. pimeässä. Ne pestiin kahdesti ja solujen suspendoinnin jälkeen Flow Cytometry Staining Bufferiin suoritettiin sytometrinen analyysi. Analyysi suoritettiin käyttämällä virtaussytometristä BD FACSCanto II:ta (BD Biosciences, San Diego, USA). Mittaukset suoritettiin BDFACS Diva -ohjelmistolla.

Säätelevien T-lymfosyyttien prosenttiosuuden arviointi.

Säätelevien T-lymfosyyttien prosenttiosuuden arviointi perifeerisen veren mononukleaarisolujen joukossa sekä terveissä ja neoplastisissa kudoksissa tehtiin virtaussytometriamenetelmällä käyttäen Human Treg Flow™ -sarjaa (FOXP3 Alexa Fluor® 488 / CD4 PE-Cy5/CD25 PE, BioLegend®). , USA) käyttämällä FACSCanto-laitetta (BD Biosciences, San Diego, USA).

iNKT-solualapopulaation määritys virtaussytometrialla

Perifeerisestä verestä eristettyjä mononukleaarisia soluja, terveitä kudoksia ja epiteelin munasarjakasvaimia inkuboitiin sopivan tilavuuden kanssa (valmistajien suosittelemien menetelmien mukaisesti) sopivia monoklonaalisia vasta-aineita: anti-iNKT FITC (anti-Vα24) (cat#558371, klooni 6B11, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), anti-CD3 PE (Cat #554829, klooni G4.18, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) ja anti-CD161-PE f (klooni Dx12, Cat# 550968, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA). Valmistettuja näytteitä inkuboitiin 20 minuuttia. huoneenlämmössä pimeässä. Kun solut oli pesty kahdesti puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS), ne alistettiin välittömästi sytometriselle analyysille. Tietojen hankinta ja analyysi suoritettiin käyttämällä FACS Calibur -virtaussytometriä (Becton Dickinson, New Jersey, USA). Ekspressoivat solut iNKT+/CD3+/CD161+ luokiteltiin CD3+:ksi

Proteiinin HE4, CA125 ja ROMA-algoritmin pitoisuuden arviointi.

Kaikilta potilailta otettiin näytteet ennen leikkausta ja 3 ml verta kerättiin. Seerumi sentrifugoitiin 2000 x g:ssä ja säilytettiin -20 ja -80 °C:ssa käyttöön asti. CA-125:n ja HE4:n seerumitasot havaittiin käyttämällä täysin automaattista kemiluminesenssianalysaattoria Cobs601 ja testimenettely suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Seuraavaksi seerumin HE4- ja CA-125-tasot laskettiin ROMA-indeksin arvolle käyttämällä munasarjasyövän riskinarviointiohjelmiston Roche ROMA -indeksiä. Seerumin HE4:n ja CA-125:n vertailualue oli <140 pmol/l ja <32 U/ml, vastaavasti.

Epiteliaalisen munasarjasyövän (ROMA) riskin arviointi ROMA-indeksi laskettiin HE4- ja CA-125-tasojen perusteella. HE4- ja CA-125-määrät syötettiin munasarjasyövän riskinarviointiohjelmistoon, minkä jälkeen laskettiin automaattisesti vastaava ROMA-indeksi. ROMA-indeksin premenopausaalinen laskentakaava oli: 12+2,38 × LN(HE4)+0,062 6 × LN(CA-125). ROMA-indeksin postmenopausaalinen laskentakaava oli: 8,09+1,04 × LN(HE4)+0,732 × LN(CA-125). Premenopausaalisilla naisilla, joiden ROMA-arvo on ≥11,4, oli suurempi riski sairastua munasarjasyöpään. Postmenopausaalisilla naisilla, joiden ROMA-arvo oli ≥29,9, oli suurempi munasarjasyövän riski.