スイープレーザー活性化システムの有効性の定量的評価

適格基準 研究集団は、根尖性歯周炎病変を有する歯の非外科的歯内治療のために、イスタンブール メディポール大学歯科学校の歯内治療クリニックに来院した 20 人の患者 (19 ～ 66 歳) で構成されました。 慢性根尖性歯周炎病変の臨床的証拠およびレントゲン写真的証拠を示す20本の歯がこの研究に含まれた。 レントゲン写真では、根尖周囲の放射線透過性の直径は 2 ～ 7 mm の範囲でした。 根尖性歯周炎の歯は治療が必要でした。 選択された歯は、ラバーダムで適切に隔離するのに十分なクラウン構造を持ち、歯周ポケットや4mmより深いアタッチメントレベルがないことを示しました。 次のような除外基準も適用されました: 過去 3 か月以内に抗生物質を投与された患者または一般的な病気にかかっている患者の歯、ラバーダムで適切に分離できなかった歯、冠状動脈シーリングのない歯、歯周ポケットのある歯深さ > 4 mm;歯冠/歯根骨折のある歯。 各患者から 1 本の歯のみが含まれていました。

根管治療手順とサンプリング ゴムダムと無菌技術は、歯内再治療全体で使用されました。 プラーク除去とラバーダム分離の後、術野を 3% 過酸化水素で洗浄し、2.5% NaOCl 溶液で消毒しました。 その後、すべての冠状修復物、ポスト、虫歯の欠損が取り除かれ、根管充填物が適切に露出したときにアクセスの準備が完了しました。 その後、歯（歯髄チャンバーを含む）、クランプ、および隣接するラバーダムをもう一度2.5％NaOClで消毒し、続いて細菌学的サンプリングとの干渉を避けるために10％チオ硫酸ナトリウムで不活化しました。 無菌コントロール サンプル (SR1) は、取り外し可能なヘッドを備えた無菌オムニ スワブ (Whatman FTA、Sigma-Aldrich) を使用して歯の表面から採取しました。 ペーパーポイントを、-20℃で保存されたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を含むクリオチューブに移しました。 いずれの場合も、微生物評価を単一の生態学的環境に限定するために、単一の根管がサンプリングされました。 多根歯では、根尖病変のある歯根が選択されました。 すべての根に根尖病変があった場合は、幅の広い管が選択されました。

作業長 (WL) は、頂点ロケーター (Raypex6; VDW GmbH、ミュンヘン、ドイツ) を使用して先端孔の 1 mm 短い位置に設定され、すべての充填材が除去されていることを確認するために根尖周囲のレントゲン写真が撮影されました。 残留物質を除去し、試料採取前に管を湿らせるために、無菌生理食塩水による洗浄を行った。 次に、運河を生理食塩水で満たしたままにし、小さなハンド器具を WL に配置し、運河の壁をやさしくやすりで磨くために使用しました。 最初の微生物学的サンプル (S1) は、WL に連続して配置された滅菌紙ポイントで根管から採取されました。 3 つの無菌紙のポイントが、サンプリングのために根管に挿入されました。 各ペーパーポイントは、運河に約1分間放置されました。 ハンドルのないペーパーポイントと歯内治療用ハンド器具の両方を、-20°Cで保存された300μlのPBS溶液を含むクライオチューブに移しました。 サンプルは、コールドチェーンでさらに分析するために遺伝子分析研究所に移されました。

ProTaper Next を使用して根管を準備しました。 Dentsply-Sirona、Ballaigues、Isviçre ファイルを使用し、2.5% NaOCl で灌漑します。 運河は、作業長でサイズ 35 (AS35) に先端的に拡大されました。 器具を交換するたびに、作業長より 1 ～ 2 mm 短い 30 ゲージのサイドベント針を使用して、根管を 5 ml の 2.5% NaOCl 溶液で洗浄しました。 したがって、合計 30 mL の洗浄液が使用されました。 計装が完了した後、スミア層を 2 mL の 17% EDTA で除去し、これを管内に 3 分間放置し、続いて 2.5% NaOCl で除去しました。 根管を滅菌ペーパーポイントで乾燥させ、2mlの10%チオ硫酸ナトリウムで1分間洗い流し、NaOCl溶液を不活化した。 次に、サンプル（Ｓ２）を、Ｓ１について記載したように管から採取した。 これに続いて、ＮａＯＣｌを下記のように撹拌／活性化した。

スイープ グループ: スイープ ファイバー チップ (25 μ s 超短デュアル パルス モード自動スイープ モード) が Er:YAG レーザー ソース (2,940 nm、1 パルスあたり 20 mJ、15 Hz、0.3 W の出力、および 50 μ 秒のパルス) に挿入されました。周波数）。 アクセス キャビティに配置された SWEEPS チップは安定した位置に保持され、活性化は、PIPS グループについて説明した同量の洗浄液を使用して、同じ方法を使用して SWEEPS モードで実行されました。

PUI グループ: 洗浄液は、超音波チップ (IRRI S 21/25; VDW、ミュンヘン、ドイツ) を超音波装置 (VDW Ultra; VDW、ミュンヘン、ドイツ) に適合させることによって使用されました。 チップは合計 3 回活性化され、各サイクルは 20 秒間持続し、1 ml の 3% NaOCl を使用しました。 次いで、２ｍｌの１７％ＥＤＴＡ溶液を上記のように１分間活性化した。 超音波チップは、運河の壁に触れないように、作業長の 2 mm 後ろに配置されました。

最後に、両方のグループの管を乾燥させ、2 mL の 10% チオ硫酸ナトリウムで 1 分間すすぎました。 活性化後サンプル（S3）は、活性化前サンプルを収集してPCR分析に送ったのと同じ方法で得た。 根管治療の完了は、ガッタパーチャの横方向の凝縮を使用して根の充填を進めました。 アクセスキャビティはコンポジットレジンで修復され、最終的なレントゲン写真が撮られました。 根管および微生物サンプリング手順はすべて、1 人の経験豊富な歯内治療医によって実施されました。 計装前、計装および灌漑活性化システムの使用後、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ddPCR）によって、総細菌量、および腸球菌の量を測定しました。

総細菌量、ならびにエンテロコッカス・フェカリスの量を、機器の導入前、機器の導入および管内薬剤の使用後に、ｄｄＰＣＲによって測定した。

ゲノム DNA の分離と DNA 濃度の測定 DNA は、QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen、ドイツ) を使用して、製造元が推奨するプロトコルに従って抽出しました。 DNA 分離の前に、PBS 溶液へのすべての細菌の分解を確実にするために、10 分ごとに 30 秒間ボルテックスすることにより、サンプル (紙の先端を備えたチューブ) を 50 ～ 60 °C で消化しました。 その後、ペーパーポイントを懸濁液から無菌的に除去し、細菌懸濁液を5000gで10分間遠心分離することによりペレット化した。 次いでペレットをＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ ＧｍｂＨ、ヒルデン、ドイツ）から供給された１８０μｌの緩衝液ＡＴＬに再懸濁し、２０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。 サンプルを56℃で3時間インキュベートした。 続いて、QIAamp DNA Mini Kit のプロトコールに従って、全細菌ゲノム DNA を分離しました。 各サンプルの DNA 溶液の最終量は 150 μL であり、計算中に考慮されました。 DNA 濃度 (260 nm での吸光度) は分光光度計 (Promega Quantifluor) で測定しました。

16S rRNA 遺伝子の増幅 Universal および Enterococcus 16S rRNA 遺伝子のプライマーは、この研究で設計されました。 QIAamp DNA Mini Kit を使用してサンプルから DNA を抽出した後、ユニバーサル E8F フォワード プライマー (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') とユニバーサル E1115R リバース プライマー (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') を使用して、700 ～ 800 bp の 16S rRNA 配列を増幅しました。 59. 分離された各菌株の PCR 反応の最終容量は 25 µl に調整されました。 16S rRNA遺伝子の増幅反応は以下の条件で行った。 95°C で 3 分間の予備変性を 1 サイクル、95°C で 30 秒間、55°C で 30 秒間、および 72°C で 30 秒間を 35 サイクル、72°C で 10 分間の最終伸長ステップで継続.

ＰＣＲ産物は、Ｔｒｉｓ／ＢｏｒａｔＥ／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中の２％アガロースゲル（臭化エチジウム含有）を用いた電気泳動によって分析し、ゲルを紫外線下（１４０Ｖで２０分間）で分析した。 それらの画像は、紫外線照明の下で視覚化されました。 さらに、ddPCR に使用されるプライマーの制御と最適化も従来の PCR で行われました。

16S rRNA 遺伝子の精製とシークエンシング PCR 反応後、Exonuclease I と Alkaline Phosphatase 酵素を含む ExoSap-IT (Thermo、PN: 78201.1.ML) で余分なプライマーとヌクレオチドを加水分解することにより、PCR 産物の精製を行います。 ExoSap-IT 2 μl を、各サンプルの PCR 産物 5 μl と混合しました。 ExoSap 反応は、37 °C で 15 分間 (酵素活性化)、続いて 80 °C で 15 分間 (不活性化) 実行されます。 シーケンス反応は、Bigdye™ Terminator v3.1 サイクル シーケンス キット (Thermo) を使用して実行されました。 反応は、すべての分離株のキットのマニュアルに従って実行されました。

生成物を Exosap で精製後、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) を用いて以下の条件でシーケンス反応を行った。 シーケンス PCR の後、BigDye 産物をコロン法で精製しました。 このプロセスには、Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research、米国) を使用しました。 すべてのサンプルは、キットに記載されているプロトコルに従って精製され、3130XL 遺伝子分析装置で実行されました。

ドロップレット デジタル PCR (ddPCR) ドロップレット デジタル PCR (ddPCR) は、総細菌およびエンテロコッカス フェカリス種に特異的な 16S rRNA 領域に従って設計されたプライマーを使用して実行されました。 プライマー ペアは、総細菌の場合は 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' および 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3、ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' および ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG でした。 -Enterococcus Faecalis の 3' プライマー ペア。 PCR反応では、マークのないプライマーペアで増幅されたアンプリコンを、Eva-Green色素で標識することにより分析しました。 Enterococcus および全 16S rRNA の絶対定量のために、同じサンプルからの 2 つのプライマー ペアを使用して PCR を実施しました。 10 μL の 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad、cat. いいえ。 1864034)、9 µL のヌクレアーゼフリー水、0.25 µL のフォワードプライマーとリバースプライマーの両方、および各サンプルから 2 ng の DNA サーマルサイクリング条件は、95℃で 5 分間、その後 95℃で 30 秒間を 40 サイクル、 60°C で 1 分間、4°C で 5 分間、90°C で 5 分間の 2 つの最終ステップで、4°C を無限に保持します。 PCR が完了した後、密封されたプレートを QX200 Droplet Reader (Bio-Rad、cat. いいえ。 1864003)。