Kwantitatieve beoordeling van de werkzaamheid van Sweeps-laseractiveringssystemen

Geschiktheidscriteria De onderzoekspopulatie bestond uit 20 patiënten (leeftijd 19-66 jaar) die zich presenteerden bij de endodontische kliniek van de Medipol University Dental School in Istanbul, voor niet-chirurgische endodontische behandeling van tanden met laesies van apicale parodontitis. 20 tanden die klinisch en radiografisch bewijs vertoonden van chronische laesies van apicale parodontitis werden in deze studie opgenomen. Radiografisch varieerde de diameter van de periapicale radiolucentie van 2 tot 7 mm. Tanden met apicale parodontitis hadden behandeling nodig. Geselecteerde tanden hadden voldoende kroonstructuur voor adequate isolatie met een rubberdam en vertoonden de afwezigheid van parodontale pockets of aanhechtingsniveau dieper dan 4 mm. Uitsluitingscriteria werden ook als volgt toegepast: tanden van patiënten die in de afgelopen 3 maanden antibiotica hadden gekregen of die een algemene ziekte hadden, tanden die niet goed konden worden geïsoleerd met rubberdam, tanden zonder coronaire afsluiting, tanden met parodontale pocket diepte >4 mm; en tanden met kroon/wortelbreuk. Van elke patiënt werd slechts één tand opgenomen.

Wortelkanaalbehandelingsprocedures en bemonstering Rubberdam en een aseptische techniek werden gebruikt tijdens de endodontische herbehandeling. Na verwijdering van tandplak en rubberdamisolatie werd het operatieveld gereinigd met 3% waterstofperoxide en gedesinfecteerd met 2,5% NaOCl-oplossing. Vervolgens werden alle coronale restauraties, stiften en carieuze defecten verwijderd en was de voorbereiding van de toegang voltooid toen de wortelkanaalvulling goed zichtbaar was. Daarna werden de tand (inclusief de pulpakamer), de klem en de aangrenzende rubberdam opnieuw gedesinfecteerd met 2,5% NaOCl, gevolgd door inactivatie met 10% natriumthiosulfaat om interferentie met bacteriologische bemonstering te voorkomen. Steriliteitscontrolemonsters (SR1) werden van het tandoppervlak genomen met een steriele Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) met een uitwerpbare kop. Papierpunten werden overgebracht naar cryobuisjes die fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevatten, opgeslagen bij -20°C. In elk geval werd een enkel wortelkanaal bemonsterd om de microbiële evaluatie te beperken tot een enkele ecologische omgeving. Bij tanden met meerdere wortels werd de wortel met de periapicale laesie geselecteerd. Als er periapicale laesies waren in alle wortels, werd het bredere kanaal gekozen.

De werklengte (WL) werd vastgesteld op 1 mm kort van het apicale foramen met een apex locator (Raypex6; VDW GmbH, München, Duitsland), en vervolgens werden periapicale röntgenfoto's gemaakt om ervoor te zorgen dat al het vulmateriaal was verwijderd. Irrigatie met een steriele zoutoplossing werd uitgevoerd om eventueel achtergebleven materiaal te verwijderen en het kanaal te bevochtigen voorafgaand aan de monsterafname. Vervolgens werd het kanaal gevuld met zoutoplossing en werd een klein handinstrument bij de WL geplaatst en gebruikt om de kanaalwanden voorzichtig te vijlen. Een eerste microbiologisch monster (S1) werd uit het wortelkanaal genomen met achtereenvolgens steriele papierpunten op de WL. Drie steriele papierpunten werden in het wortelkanaal ingebracht voor bemonstering. Elke papierpunt bleef ongeveer 1 minuut in het kanaal. Zowel de paperpoints als het endodontische handinstrument, zonder het handvat, werden overgebracht naar cryobuisjes met 300 μl PBS-oplossing, bewaard bij -20°C. De monsters werden overgebracht naar het laboratorium voor genetische analyse voor verdere analyse in de koelketen.

Wortelkanalen werden voorbereid met behulp van de ProTaper Next; Dentsply-Sirona, Ballaigues, İsviçre vijlen en geïrrigeerd met 2,5% NaOCl. De kanalen werden apicaal vergroot tot maat 35 (AS35) op de werklengte. Tussen elke instrumentwisseling werd het wortelkanaal geïrrigeerd met 5 ml 2,5% NaOCl-oplossing met behulp van een 30-gauge naald met zijopeningen, die 1 tot 2 mm korter dan de werklengte werd geplaatst. Daarom werd in totaal 30 ml van de irrigatieoplossing gebruikt. Nadat de instrumentatie was voltooid, werd de smeerlaag verwijderd met 2 ml 17% EDTA, dat gedurende 3 minuten in het kanaal werd gelaten, gevolgd door 2,5% NaOCl. Het wortelkanaal werd gedroogd met steriele papierpunten en gedurende 1 minuut gespoeld met 2 ml 10% natriumthiosulfaat om de NaOCl-oplossing te inactiveren. Vervolgens werd een monster (S2) uit de kanalen genomen zoals beschreven voor S1. Hierna werd het NaOCl geroerd/geactiveerd zoals hieronder beschreven.

Sweeps-groep: de SWEEPS-fibertip (25 µs ultrakorte dubbele pulsmodus-Auto SWEEPS-modus) werd ingebracht in de Er:YAG-laserbron (2940 nm, 20 mJ per puls, 15 Hz, 0,3 W vermogen en 50 µs puls frequentie). De SWEEPS-tip die in de toegangsholte was geplaatst, werd in een stabiele positie gehouden en activering werd uitgevoerd in de SWEEPS-modus met dezelfde methode met dezelfde hoeveelheid irrigatieoplossingen als beschreven voor de PIPS-groep.

PUI-groep: De irrigatieoplossing werd gebruikt door een ultrasone tip (IRRI S 21/25; VDW, München, Duitsland) aan te passen aan een ultrasoon apparaat (VDW Ultra; VDW, München, Duitsland). De tip werd in totaal drie keer geactiveerd, waarbij elke cyclus 20 seconden duurde en waarbij 1 ml 3% NaOCl werd gebruikt. Vervolgens werd 2 ml 17% EDTA-oplossing gedurende 1 minuut geactiveerd zoals hierboven beschreven. De ultrasone punt werd 2 mm achter de werklengte geplaatst zonder de kanaalwanden te raken.

Ten slotte werden de kanalen in beide groepen gedroogd en gedurende 1 minuut gespoeld met 2 ml 10% natriumthiosulfaat. Het post-activeringsmonster (S3) werd op dezelfde manier verkregen als het pre-activeringsmonster dat werd verzameld en verzonden voor de PCR-analyse. De wortelkanaalbehandeling is afgerond met wortelvulling met behulp van laterale condensatie van guttapercha. Toegangsholten werden hersteld met composiethars en er werd een definitieve röntgenfoto gemaakt. Alle wortelkanaalbehandelingen en microbiële bemonsteringsprocedures werden uitgevoerd door één enkele ervaren endodontist. De totale bacteriële belasting, evenals de hoeveelheid Enterococcus faecalis, werd bepaald vóór instrumentatie, na instrumentatie en gebruik van de irrigatie-activeringssystemen, door middel van druppel digitale polymerasekettingreactie (ddPCR).

De totale bacteriële belasting, evenals de hoeveelheid Enterococcus faecalis, werd bepaald voor instrumentatie, na instrumentatie en gebruik van de intracanale medicijnen door middel van ddPCR.

Isolatie van genomisch DNA en meting van DNA-concentratie DNA werd geëxtraheerd met behulp van de QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Duitsland) volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol. Voorafgaand aan DNA-isolatie werden monsters (de buisjes met papieren punten) gedigereerd bij 50-60°C DOOR vortexen gedurende 30 seconden in elke 10 min om disaggregatie van alle bacteriën in de PBS-oplossing te verzekeren. Daarna werden de paperpoints aseptisch uit de suspensie verwijderd en werd de bacteriesuspensie gepelleteerd door gedurende 10 minuten te centrifugeren bij 5000 g. De pellet werd vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 180 µl buffer ATL geleverd door QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Duitsland) en 20 µl proteïnase K (20 mg/ml) werd toegevoegd. Monsters werden gedurende 3 uur bij 56°C geïncubeerd. Vervolgens werd totaal bacterieel genomisch DNA geïsoleerd volgens het protocol van de QIAamp DNA Mini Kit. Het uiteindelijke volume DNA-oplossing van elk monster was 150 μL en werd bij de berekening in aanmerking genomen. DNA-concentratie (absorptie bij 260 nm) werd bepaald met een spectrofotometer (Promega Quantifluor).

Amplificatie van 16S-rRNA-genen In dit onderzoek werden primers voor Universal- en Enterococcus 16S-rRNA-genen ontworpen. Na DNA-extractie van monsters met QIAamp DNA Mini Kit, werden 700-800 bp van 16S rRNA-sequenties geamplificeerd met behulp van universele E8F forward primer (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') en universele E1115R reverse primer (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. Het eindvolume van PCR-reacties voor elke geïsoleerde bacteriestam werd aangepast tot 25 µl. De amplificatiereacties van 16S-rRNA-genen werden uitgevoerd onder de volgende omstandigheden. 1 predenaturatiecyclus bij 95°C gedurende 3 minuten, 35 cycli van 95°C gedurende 30 seconden, 55°C gedurende 30 seconden en 72°C gedurende 30 seconden die doorgaan met een laatste verlengingsstap bij 72°C gedurende 10 minuten .

De PCR-producten werden geanalyseerd door middel van elektroforese met behulp van 2% agarosegel (bevattende ethidiumbromide) in Tris/BoratE/EDTA (TBE)-buffer, waarbij gels werden geanalyseerd onder ultraviolet licht (bij 140V gedurende 20 minuten). Hun beelden werden gevisualiseerd onder ultraviolette verlichting. Bovendien werd de controle en optimalisatie van primers voor gebruik voor ddPCR ook gedaan in conventionele PCR.

Zuivering en sequentiëring van het 16S rRNA-gen Na de PCR-reacties wordt de zuivering van PCR-producten gedaan door de overtollige primers en nucleotiden te hydrolyseren met ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) dat exonuclease I en alkalische fosfatase-enzymen bevat. Voor elk monster werd 2 µl ExoSap-IT gemengd met 5 µl PCR-product. De ExoSap-reactie wordt uitgevoerd bij 37 °C gedurende 15 minuten (enzymactivering), gevolgd door 15 minuten (inactivering) bij 80 °C. Sequentiereacties werden uitgevoerd met behulp van Bigdye™ Terminator v3.1 cyclus sequencing kit (Thermo). De reacties werden uitgevoerd volgens de kithandleiding voor alle geïsoleerde stammen.

Na zuivering van de producten met Exosap werd de sequentiereactie uitgevoerd met BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) onder de volgende omstandigheden. Na de sequentie-PCR werden BigDye-producten gezuiverd volgens de colonmethode. Voor dit proces werd Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, VS) gebruikt. Alle monsters werden gezuiverd in overeenstemming met het protocol in de kit en uitgevoerd op de 3130XL genetische analysator.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) werd uitgevoerd met behulp van primers die waren ontworpen volgens het 16S rRNA-gebied dat specifiek is voor de totale bacteriën en Enterococcus faecalis-soorten, na sequentiebepaling, absolute kwantificering van de bacteriesoorten gevonden in het paper-point-monster. Primerparen waren 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' en 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 voor totale bacteriën en ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCCGAGT-3' en ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3'-primerparen voor Enterococcus Faecalis. In de PCR-reactie werden amplicons geamplificeerd met niet-gemarkeerde primerparen geanalyseerd door labeling met Eva-Green-kleurstof. Voor absolute kwantificering van Enterococcus en totaal 16S rRNA werd PCR uitgevoerd met twee primerparen van hetzelfde monster. 20 µL PCR-mix met 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, cat. Nee. 1864034), 9 µl nucleasevrij water, 0,25 µl zowel voorwaartse als achterwaartse primer en 2 ng DNA van elk monster. 60◦C gedurende 1 minuut en twee laatste stappen bij 4◦C gedurende 5 minuten en 90◦C gedurende 5 minuten met een oneindige hold van 4◦C. Nadat de PCR was voltooid, werd de verzegelde plaat overgebracht naar de plaathouder van de QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, cat. Nee. 1864003).