Kvantitativ bedömning av effektiviteten hos Sweeps laseraktiveringssystem

Behörighetskriterier Studiepopulationen bestod av 20 patienter (i åldern 19-66 år) som besökte endodontikliniken vid Istanbul Medipol University Dental School för icke-kirurgisk endodontisk behandling av tänder med apikala parodontitskador. 20 tänder som uppvisar kliniska och radiografiska bevis för kroniska apikala parodontitlesioner inkluderades i denna studie. Radiografiskt varierade diametern på den periapikala radiolucensen från 2 till 7 mm. Tänder med apikal parodontit hade krävt behandling. Utvalda tänder hade tillräckligt med kronstruktur för adekvat isolering med en gummidamm och visade frånvaro av parodontala fickor eller fästnivå djupare än 4 mm. Uteslutningskriterier tillämpades också enligt följande: tänder från patienter som fått antibiotika under de senaste 3 månaderna eller som hade någon allmän sjukdom, tänder som inte kunde isoleras ordentligt med gummidamm, tänder utan kranskärlsförsegling, tänder med parodontala ficka djup >4 mm; och tänder med krona/rotfraktur. Endast en tand ingick från varje patient.

Rotkanalbehandlingsprocedurer och provtagning Gummifördämning och en aseptisk teknik användes under hela den endodontiska återbehandlingen. Efter avlägsnande av plack och isolering av gummidamm, rengjordes operationsfältet med 3 % väteperoxid och desinficerades med 2,5 % NaOCl-lösning. Sedan togs alla koronala restaureringar, stolpar och kariesdefekter bort och tillträdesförberedelserna avslutades när rotfyllningen var ordentligt exponerad. Därefter desinficerades tanden (inklusive massakammaren), klämman och den intilliggande gummifördämningen återigen med 2,5 % NaOCl, följt av inaktivering med 10 % natriumtiosulfat för att undvika interferens med bakteriologisk provtagning. Sterilitetskontrollprover (SR1) togs från tandytan med en steril Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) med ett utkastbart huvud. Papperspunkter överfördes till kryorör innehållande fosfatbuffrad saltlösning (PBS) förvarad vid -20°C. I varje fall togs en enda rotkanal prover för att begränsa den mikrobiella utvärderingen till en enda ekologisk miljö. I flerrotade tänder valdes roten med den periapikala lesionen. Om det fanns periapikala lesioner i alla rötter valdes den bredare kanalen.

Arbetslängden (WL) fastställdes 1 mm kort från det apikala foramen med en apexlocator (Raypex6; VDW GmbH, München, Tyskland), och sedan togs periapikala röntgenbilder för att säkerställa att allt fyllnadsmaterial avlägsnades. Sköljning med steril koksaltlösning utfördes för att avlägsna eventuellt kvarvarande material och för att fukta kanalen före provtagning. Därefter lämnades kanalen fylld med saltlösning och ett litet handinstrument placerades vid WL och användes för att försiktigt fila kanalväggarna. Ett initialt mikrobiologiskt prov (S1) togs från rotkanalen med sterila papperspunkter placerade i följd vid WL. Tre sterila papperspunkter sattes in i rotkanalen för provtagning. Varje papperspunkt lämnades i kanalen i cirka 1 minut. Både pappersspetsarna och det endodontiska handinstrumentet, utan handtaget, överfördes till kryorör innehållande 300 μl PBS-lösning lagrad vid -20°C. Proverna överfördes till genetiskt analyslaboratorium för vidare analys i kylkedjan.

Rotkanaler förbereddes med hjälp av ProTaper Next; Dentsply-Sirona, Ballaigues, İsviçre-filar och bevattnade med 2,5 % NaOCl. Kanalerna förstorades apikalt till storlek 35 (AS35) vid arbetslängden. Mellan varje instrumentbyte spolades rotkanalen med 5 ml 2,5 % NaOCl-lösning genom att använda en 30-gauge sidoventilerad nål, som placerades 1 till 2 mm kortare än arbetslängden. Följaktligen användes totalt 30 ml av spolningslösningen. Efter att instrumenteringen avslutats avlägsnades utstrykningsskiktet med 2 ml 17 % EDTA, som lämnades i kanalen i 3 minuter, följt av 2,5 % NaOCl. Rotkanalen torkades med sterila pappersspetsar och spolades med 2 ml 10% natriumtiosulfat under 1 min för att inaktivera NaOCl-lösningen. Därefter togs ett prov (S2) från kanalerna som beskrivits för S1. Efter detta omrördes/aktiverades NaOCl såsom beskrivs nedan.

Sweeps-grupp: SWEEPS-fiberspetsen (25 µs ultrakort dubbelpulsläge - Auto SWEEPS-läge) sattes in i Er:YAG-laserkällan (2 940 nm, 20 mJ per puls, 15 Hz, 0,3 W effekt och 50 µs puls frekvens). SWEEPS-spetsen placerad i åtkomsthålan hölls i ett stabilt läge och aktivering utfördes i SWEEPS-läget med samma metod med samma mängd bevattningslösningar som beskrivs för PIPS-gruppen.

PUI-grupp: Bevattningslösningen användes genom att anpassa en ultraljudsspets (IRRI S 21/25; VDW, München, Tyskland) till en ultraljudsanordning (VDW Ultra; VDW, München, Tyskland). Spetsen aktiverades totalt tre gånger, med varje cykel som varade 20 s och involverade användning av 1 ml 3% NaOCl. Sedan aktiverades 2 ml 17% EDTA-lösning under 1 min enligt beskrivningen ovan. Ultraljudsspetsen placerades 2 mm bakom arbetslängden utan att röra kanalväggarna.

Slutligen torkades kanalerna i båda grupperna och sköljdes med 2 ml 10% natriumtiosulfat under 1 min. Efteraktiveringsprovet (S3) erhölls på samma sätt som föraktiveringsprovet samlades in och skickades för PCR-analys. Slutförandet av rotbehandlingen fortsatte med rotfyllning med lateral kondensering av guttaperka. Åtkomsthåligheter återställdes med kompositharts och en sista röntgenbild togs. Alla rotkanal- och mikrobiella provtagningsprocedurer utfördes av en enda erfaren endodontist. Den totala bakteriemängden, såväl som mängden Enterococcus faecalis, bestämdes före instrumentering, efter instrumentering och användning av irrigationsaktiveringssystem, med hjälp av digitala droppar av polymeraskedjereaktion (ddPCR).

Den totala bakteriemängden, såväl som mängden Enterococcus faecalis, bestämdes före instrumentering, efter instrumentering och användning av de intracanala läkemedlen, med hjälp av ddPCR.

Genomisk DNA-isolering och mätning av DNA-koncentration DNA extraherades med QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tyskland) enligt det protokoll som rekommenderas av tillverkaren. Före DNA-isolering digererades prover (rören med pappersspetsar) vid 50-60°C GENOM att vortexa i 30 sekunder var 10:e minut för att säkerställa sönderdelning av alla bakterier i PBS-lösningen. Efteråt avlägsnades pappersspetsarna aseptiskt från suspensionen och bakteriesuspensionen pelleterades genom centrifugering under 10 minuter vid 5000 g. Pelleten återsuspenderades sedan i 180 µl buffert ATL tillhandahållen av QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Tyskland) och 20 µl proteinas K (20 mg/ml) tillsattes. Prover inkuberades under 3 timmar vid 56°C. Därefter isolerades totalt bakteriellt genomiskt DNA enligt protokollet för QIAamp DNA Mini Kit. Den slutliga volymen av DNA-lösning av varje prov var 150 μL och togs med i beräkningen under beräkningen. DNA-koncentration (absorbans vid 260 nm) bestämdes med en spektrofotometer (Promega Quantifluor).

Amplifiering av 16S rRNA-gener Primers för Universal och Enterococcus 16S rRNA-gener designades i denna studie. Efter DNA-extraktion av prover med QIAamp DNA Mini Kit, amplifierades 700-800 bp av 16S rRNA-sekvenser genom att använda universell E8F framåtriktad primer (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') och universell E1115R omvänd primer (5'-AGGGGTTG3'CTTT) 59. Den slutliga volymen av PCR-reaktioner för varje isolerad bakteriestam justerades till 25 ul. Amplifieringsreaktionerna av 16S rRNA-gener utfördes med följande betingelser. 1 cykel av fördenaturering vid 95°C i 3 minuter, 35 cykler av 95°C i 30 sekunder, 55°C i 30 sekunder och 72°C i 30 sekunder som fortsätter med ett sista förlängningssteg vid 72°C i 10 minuter .

PCR-produkterna analyserades genom elektrofores med användning av 2% agarosgel (innehållande etidiumbromid) i Tris/BoratE/EDTA (TBE)-buffert, varvid geler analyserades under ultraviolett ljus (vid 140V under 20 minuter). Deras bilder visualiserades under ultraviolett belysning. Dessutom gjordes kontrollen och optimeringen av primrar som ska användas för ddPCR även i konventionell PCR.

Rening och sekvensering av 16S rRNA-genen Efter PCR-reaktionerna görs reningen av PCR-produkter genom att hydrolysera överskottet av primers och nukleotider med ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) innehållande exonukleas I och alkaliska fosfatasenzymer. 2 µl ExoSap-IT blandades med 5 µl PCR-produkt för varje prov. ExoSap-reaktionen utförs vid 37 °C i 15 minuter (enzymaktivering) följt av 15 minuter (inaktivering) vid 80 °C. Sekvensreaktioner utfördes med hjälp av Bigdye™ Terminator v3.1 cykelsekvenseringssats (Thermo). Reaktionerna utfördes enligt kitmanualen för alla isolerade stammar.

Efter rening av produkterna med Exosap utfördes sekvensreaktionen med BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) under följande förhållanden. Efter sekvens-PCR renades BigDye-produkter med kolonmetod. Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA) användes för denna process. Alla prover renades i enlighet med protokollet i kitet och utfördes på den genetiska analysatorn 3130XL.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) utfördes med hjälp av primers utformade enligt 16S rRNA-regionen som är specifik för de totala bakterierna och Enterococcus faecalis-arterna, efter sekvensering, absolut kvantifiering från bakteriearterna som hittades i papperspunktprovet. Primerpar var 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' och 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 för totala bakterier och ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' och ENT-R-5'-GCCACATGCGGCATA -3' primerpar för Enterococcus Faecalis. I PCR-reaktionen analyserades amplikoner amplifierade med omärkta primerpar genom märkning med Eva-Green-färgämne. För absolut kvantifiering av Enterococcus och totalt 16S rRNA utfördes PCR med två primerpar från samma prov. 20 µL PCR-blandning innehållande 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, kat. Nej. 1864034), 9 µL nukleasfritt vatten, 0,25 µL av både framåt och bakåt primer och 2 ng DNA från varje prov. Termiska cyklingsförhållanden var: 95 ◦C i 5 minuter, sedan 40 cykler med 95 ◦C i 30 s och 60◦C i 1 min och två sista steg vid 4◦C i 5 minuter och 90◦C i 5 minuter med 4◦C oändligt uppehåll. Efter att PCR avslutats överfördes den förseglade plattan till platthållaren på QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, kat. Nej. 1864003).