Evaluación cuantitativa de la eficacia de los sistemas de activación por láser Sweeps

Criterios de elegibilidad La población de estudio consistió en 20 pacientes (de 19 a 66 años de edad) que acudieron a la clínica de endodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad Medipol de Estambul, para el tratamiento endodóntico no quirúrgico de los dientes con lesiones de periodontitis apical. En este estudio se incluyeron 20 dientes que presentaban evidencia clínica y radiográfica de lesiones de periodontitis apical crónica. Radiográficamente, el diámetro de la radiotransparencia periapical varió de 2 a 7 mm. Los dientes con periodontitis apical habían requerido tratamiento. Los dientes seleccionados tenían suficiente estructura de corona para un aislamiento adecuado con un dique de goma y mostraban ausencia de bolsas periodontales o nivel de inserción más profundo de 4 mm. También se aplicaron criterios de exclusión, de la siguiente manera: dientes de pacientes que habían recibido antibióticos en los últimos 3 meses o que tenían alguna enfermedad general, dientes que no pudieron aislarse adecuadamente con dique de goma, dientes con ausencia de sellado coronario, dientes con bolsa periodontal profundidad >4 mm; y dientes con fractura de corona/raíz. Solo se incluyó un diente de cada paciente.

Procedimientos de tratamiento del conducto radicular y toma de muestras Se utilizó un dique de goma y una técnica aséptica durante todo el retratamiento endodóntico. Después de la eliminación de la placa y el aislamiento del dique de goma, el campo operatorio se limpió con peróxido de hidrógeno al 3 % y se desinfectó con una solución de NaOCl al 2,5 %. Luego, se retiraron todas las restauraciones coronales, postes y defectos cariosos y se completó la preparación del acceso cuando el relleno del conducto radicular quedó expuesto correctamente. Posteriormente, el diente (incluida la cámara pulpar), la abrazadera y el dique de goma adyacente se desinfectaron nuevamente con NaOCl al 2,5%, seguido de la inactivación con tiosulfato de sodio al 10% para evitar interferencias con el muestreo bacteriológico. Se tomaron muestras de control de esterilidad (SR1) de la superficie del diente con un hisopo Omni estéril (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) con un cabezal eyectable. Las puntas de papel se transfirieron a criotubos que contenían una solución salina tamponada con fosfato (PBS) almacenada a -20 °C. En cada caso, se tomaron muestras de un solo conducto radicular para limitar la evaluación microbiana a un solo entorno ecológico. En dientes multirradiculares se seleccionó la raíz con la lesión periapical. Si había lesiones periapicales en todas las raíces, se seleccionó el canal más ancho.

La longitud de trabajo (WL) se estableció 1 mm por debajo del agujero apical con un localizador de ápices (Raypex6; VDW GmbH, Munich, Alemania), y luego se tomaron radiografías periapicales para asegurar que se eliminó todo el material de obturación. Se realizó irrigación con solución salina estéril para eliminar cualquier resto de material y humedecer el canal antes de la toma de muestra. A continuación, el canal se dejó lleno con solución salina y se colocó un pequeño instrumento manual en la WL y se usó para limar suavemente las paredes del canal. Se tomó una muestra microbiológica inicial (S1) del conducto radicular con puntas de papel estériles colocadas consecutivamente en el WL. Se insertaron tres puntas de papel estériles en el conducto radicular para la toma de muestras. Cada punta de papel se dejó en el canal durante aproximadamente 1 minuto. Tanto las puntas de papel como el instrumento manual de endodoncia, sin mango, se transfirieron a criotubos que contenían 300 μl de solución de PBS almacenados a -20 °C. Las muestras fueron trasladadas al laboratorio de análisis genético para su posterior análisis en cadena de frío.

Los conductos radiculares se prepararon utilizando ProTaper Next; Limas Dentsply-Sirona, Ballaigues, İsviçre e irrigadas con NaOCl al 2,5%. Los canales se agrandaron apicalmente al tamaño 35 (AS35) en la longitud de trabajo. Entre cada cambio de instrumento, se irrigaba el conducto radicular con 5 ml de solución de NaOCl al 2,5 % utilizando una aguja de calibre 30 con ventilación lateral, que se colocaba de 1 a 2 mm por debajo de la longitud de trabajo. Por lo tanto, se utilizó un total de 30 mL de la solución de irrigación. Una vez finalizada la instrumentación, se eliminó el barrillo dentinario con 2 ml de EDTA al 17 %, que se dejó en el conducto durante 3 min, seguido de NaOCl al 2,5 %. El conducto radicular se secó con puntas de papel estériles y se enjuagó con 2 ml de tiosulfato de sodio al 10 % durante 1 min para inactivar la solución de NaOCl. A continuación, se tomó una muestra (S2) de los canales como se describe para S1. Después de esto, el NaOCl se agitó/activó como se describe a continuación.

Grupo de barridos: la punta de fibra SWEEPS (modo de pulso dual ultracorto de 25 µs-modo SWEEPS automático) se insertó en la fuente de láser Er:YAG (2940 nm, 20 mJ por pulso, 15 Hz, 0,3 W de potencia y pulso de 50 µs). frecuencia). La punta SWEEPS colocada en la cavidad de acceso se mantuvo en una posición estable y la activación se realizó en el modo SWEEPS usando el mismo método con la misma cantidad de soluciones de irrigación descritas para el grupo PIPS.

Grupo PUI: La solución de irrigación se utilizó adaptando una punta ultrasónica (IRRI S 21/25; VDW, Munich, Alemania) a un dispositivo ultrasónico (VDW Ultra; VDW, Munich, Alemania). La punta se activó un total de tres veces, cada ciclo duró 20 s e implicó el uso de 1 ml de NaOCl al 3%. Luego, se activaron 2 ml de una solución de EDTA al 17 % durante 1 min como se describe anteriormente. La punta ultrasónica se colocó 2 mm por detrás de la longitud de trabajo sin tocar las paredes del canal.

Finalmente, los canales de ambos grupos se secaron y enjuagaron con 2 mL de tiosulfato de sodio al 10% durante 1 min. La muestra posterior a la activación (S3) se obtuvo de la misma manera que se recolectó la muestra previa a la activación y se envió para el análisis de PCR. Finalizado el tratamiento de conductos se procedió a la obturación radicular mediante condensación lateral de gutapercha. Las cavidades de acceso se restauraron con resina compuesta y se tomó una radiografía final. Todos los procedimientos de muestreo microbiano y de conducto radicular fueron realizados por un solo endodoncista experimentado. Las cargas bacterianas totales, así como la cantidad de Enterococcus faecalis se determinaron antes de la instrumentación, después de la instrumentación y uso de los sistemas de activación del riego, mediante reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (ddPCR).

Las cargas bacterianas totales, así como la cantidad de Enterococcus faecalis se determinaron antes de la instrumentación, después de la instrumentación y uso de los medicamentos intracanal, mediante ddPCR.

Aislamiento de ADN genómico y medición de la concentración de ADN El ADN se extrajo utilizando el kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Alemania) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Antes del aislamiento del ADN, las muestras (los tubos con puntas de papel) se digirieron a 50-60 °C Agitando en vórtex durante 30 segundos cada 10 minutos para garantizar la disgregación de todas las bacterias en la solución de PBS. Posteriormente, las puntas de papel se retiraron asépticamente de la suspensión y la suspensión bacteriana se peletizó por centrifugación durante 10 min a 5000 g. A continuación, el sedimento se resuspendió en 180 µl de tampón ATL suministrado por QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) y se añadieron 20 µl de proteinasa K (20 mg/ml). Las muestras se incubaron durante 3 horas a 56 °C. Posteriormente, se aisló el ADN genómico bacteriano total según el protocolo del QIAamp DNA Mini Kit. El volumen final de solución de ADN de cada muestra fue de 150 μL y se tuvo en cuenta durante el cálculo. La concentración de ADN (absorbancia a 260 nm) se determinó con un espectrofotómetro (Promega Quantifluor).

Amplificación de genes rRNA 16S En este estudio se diseñaron cebadores para genes rRNA Universal y Enterococcus 16S. Después de la extracción de ADN de las muestras con el kit QIAamp DNA Mini, se amplificaron 700-800 pb de secuencias de ARNr 16S utilizando el cebador directo E8F universal (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') y el cebador inverso E1115R universal (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. El volumen final de las reacciones de PCR para cada cepa bacteriana aislada se ajustó a 25 µl. Las reacciones de amplificación de los genes 16S rRNA se realizaron con las siguientes condiciones. 1 ciclo de predenaturación a 95°C por 3 minutos, 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos y 72°C por 30 segundos que continúan con un paso final de extensión a 72°C por 10 minutos .

Los productos de PCR se analizaron por electroforesis utilizando gel de agarosa al 2% (que contiene bromuro de etidio) en tampón Tris/BoratE/EDTA (TBE), analizándose los geles bajo luz ultravioleta (a 140 V durante 20 minutos). Sus imágenes fueron visualizadas bajo iluminación ultravioleta. Además, el control y la optimización de los cebadores que se utilizarán para la ddPCR también se realizó en la PCR convencional.

Purificación y secuenciación del gen 16S rRNA Después de las reacciones de PCR, la purificación de los productos de PCR se realiza hidrolizando el exceso de cebadores y nucleótidos con ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) que contiene las enzimas exonucleasa I y fosfatasa alcalina. Se mezclaron 2 µl de ExoSap-IT con 5 µl de producto PCR para cada muestra. La reacción de ExoSap se realiza a 37 °C durante 15 minutos (activación enzimática) seguida de 15 minutos (inactivación) a 80 °C. Las reacciones de secuenciación se realizaron utilizando el kit de secuenciación de ciclo Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). Las reacciones se realizaron de acuerdo con el manual del kit para todas las cepas aisladas.

Después de la purificación de los productos con Exosap, la reacción de secuenciación se realizó con el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator v3.1 (Thermo) en las siguientes condiciones. Después de la secuencia PCR, los productos BigDye se purificaron por el método de colon. Para este proceso se utilizó el kit de limpieza de secuenciación de ADN Zymo ZR (Zymo Research, EE. UU.). Todas las muestras se purificaron de acuerdo con el protocolo proporcionado en el kit y se ejecutaron en el analizador genético 3130XL.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) se realizó utilizando cebadores diseñados de acuerdo con la región 16S rRNA específica para el total de bacterias y especies de Enterococcus faecalis, después de la secuenciación, la cuantificación absoluta de las especies bacterianas encontradas en la muestra de punta de papel. Los pares de cebadores fueron 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' y 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 para bacterias totales y ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCCTCCCGAGT-3' y ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3' pares de cebadores para Enterococcus Faecalis. En la reacción de PCR, los amplicones amplificados con pares de cebadores no marcados se analizaron marcando con colorante Eva-Green. Para la cuantificación absoluta de Enterococcus y 16S rRNA total, se realizó PCR con dos pares de cebadores de la misma muestra. 20 µL de mezcla de PCR que contiene 10 µL de 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, cat. No. 1864034), 9 µL de agua libre de nucleasas, 0,25 µL de cebador directo e inverso y 2 ng de ADN de cada muestra. Las condiciones del ciclo térmico fueron: 95 °C durante 5 min, luego 40 ciclos de 95 °C durante 30 s y 60 ◦C durante 1 min y dos pasos finales a 4 ◦C durante 5 minutos y 90 ◦C durante 5 minutos con una retención infinita de 4 ◦C. Una vez completada la PCR, la placa sellada se transfirió al soporte de placas del QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, cat. No. 1864003).