Avaliação quantitativa da eficácia de sistemas de ativação de laser de varredura

Critérios de elegibilidade A população do estudo consistiu em 20 pacientes (com idades entre 19 e 66 anos) que se apresentaram na clínica endodôntica da Istanbul Medipol University Dental School, para tratamento endodôntico não cirúrgico de dentes com lesões de periodontite apical. 20 dentes exibindo evidências clínicas e radiográficas de lesões de periodontite apical crônica foram incluídos neste estudo. Radiograficamente, o diâmetro da radioluscência periapical variou de 2 a 7 mm. Dentes com periodontite apical necessitaram de tratamento. Os dentes selecionados tinham estrutura de coroa suficiente para isolamento adequado com um dique de borracha e mostravam ausência de bolsas periodontais ou nível de inserção mais profundo que 4 mm. Também foram aplicados critérios de exclusão, como segue: dentes de pacientes que receberam antibióticos nos últimos 3 meses ou que apresentavam alguma doença geral, dentes que não puderam ser isolados adequadamente com dique de borracha, dentes com ausência de selamento coronário, dentes com bolsa periodontal profundidade >4 mm; e dentes com fratura de coroa/raiz. Apenas um dente foi incluído de cada paciente.

Procedimentos de tratamento do canal radicular e amostragem Barragem de borracha e uma técnica asséptica foram usados ​​durante todo o retratamento endodôntico. Após a remoção da placa e isolamento do dique de borracha, o campo operatório foi limpo com peróxido de hidrogênio a 3% e desinfetado com solução de NaOCl a 2,5%. Em seguida, todas as restaurações coronárias, pinos e defeitos cariados foram removidos e a preparação do acesso foi concluída quando a obturação do canal radicular foi devidamente exposta. Em seguida, o dente (incluindo a câmara pulpar), pinça e dique de borracha adjacente foram novamente desinfetados com NaOCl 2,5%, seguido de inativação com tiossulfato de sódio 10% para evitar interferência na amostragem bacteriológica. Amostras de controle de esterilidade (SR1) foram retiradas da superfície do dente com um cotonete estéril Omni Swab (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) com uma cabeça ejetável. As pontas de papel foram transferidas para criotubos contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) armazenada a -20°C. Em cada caso, um único canal radicular foi amostrado para limitar a avaliação microbiana a um único ambiente ecológico. Em dentes multirradiculares, a raiz com lesão periapical foi selecionada. Se houvesse lesões periapicais em todas as raízes, o canal mais largo era selecionado.

O comprimento de trabalho (WL) foi estabelecido 1 mm aquém do forame apical com um localizador de ápice (Raypex6; VDW GmbH, Munique, Alemanha) e, em seguida, radiografias periapicais foram feitas para garantir que todo o material obturador foi removido. A irrigação com solução salina estéril foi realizada para remover qualquer material remanescente e umedecer o canal antes da coleta da amostra. Em seguida, o canal foi preenchido com solução salina e um pequeno instrumento manual foi colocado no WL e usado para limar suavemente as paredes do canal. Uma amostra microbiológica inicial (S1) foi retirada do canal radicular com pontas de papel estéril colocadas consecutivamente no WL. Três pontas de papel estéril foram inseridas no canal radicular para amostragem. Cada ponta de papel foi deixada no canal por cerca de 1 minuto. Tanto as pontas de papel quanto o instrumento manual endodôntico, sem o cabo, foram transferidos para criotubos contendo 300 μl de solução PBS armazenados a -20°C. As amostras foram transferidas para laboratório de análises genéticas para posterior análise na rede de frio.

Os canais radiculares foram preparados usando o ProTaper Next; Limas Dentsply-Sirona, Ballaigues, İsviçre e irrigadas com NaOCl 2,5%. Os canais foram apicalmente alargados para o tamanho 35 (AS35) no comprimento de trabalho. Entre cada troca de instrumento, o canal radicular foi irrigado com 5 ml de solução de NaOCl a 2,5% usando uma agulha de calibre 30 com ventilação lateral, que foi colocada 1 a 2 mm antes do comprimento de trabalho. Assim, foi utilizado um total de 30 mL da solução irrigadora. Após a conclusão da instrumentação, a smear layer foi removida com 2 mL de EDTA 17%, que foi deixado no canal por 3 minutos, seguido de NaOCl 2,5%. O canal radicular foi seco com pontas de papel estéril e lavado com 2 ml de tiossulfato de sódio a 10% por 1 minuto para inativar a solução de NaOCl. Em seguida, uma amostra (S2) foi retirada dos canais conforme descrito para S1. Em seguida, o NaOCl foi agitado/ativado conforme descrito abaixo.

Grupo de varreduras: A ponta de fibra SWEEPS (modo de pulso duplo ultracurto de 25 µs - modo Auto SWEEPS) foi inserida na fonte de laser Er:YAG (2.940 nm, 20 mJ por pulso, 15 Hz, 0,3 W de potência e pulso de 50 µs frequência). A ponta SWEEPS colocada na cavidade de acesso foi mantida em posição estável, e a ativação foi realizada no modo SWEEPS usando o mesmo método com a mesma quantidade de soluções de irrigação descrito para o grupo PIPS.

Grupo PUI: A solução de irrigação foi utilizada adaptando uma ponta ultrassônica (IRRI S 21/25; VDW, Munique, Alemanha) a um aparelho ultrassônico (VDW Ultra; VDW, Munique, Alemanha). A ponteira foi ativada no total três vezes, com cada ciclo durando 20 segundos e envolvendo o uso de 1 ml de NaOCl 3%. Em seguida, 2 ml de solução de EDTA a 17% foram ativados por 1 min conforme descrito acima. A ponta ultrassônica foi colocada 2 mm atrás do comprimento de trabalho sem tocar nas paredes do canal.

Por fim, os canais de ambos os grupos foram secos e lavados com 2 mL de tiossulfato de sódio a 10% por 1 min. A amostra pós-ativação (S3) foi obtida da mesma forma que a amostra pré-ativação foi coletada e enviada para análise de PCR. A conclusão do tratamento do canal radicular prosseguiu com a obturação usando condensação lateral de guta-percha. As cavidades de acesso foram restauradas com resina composta e uma radiografia final foi feita. Todos os procedimentos de amostragem microbiana e do canal radicular foram realizados por um único endodontista experiente. As cargas bacterianas totais, bem como a quantidade de Enterococcus faecalis foram determinadas antes da instrumentação, após a instrumentação e uso dos sistemas de ativação da irrigação, por meio da reação em cadeia da polimerase digital em gotículas (ddPCR).

As cargas bacterianas totais, bem como a quantidade de Enterococcus faecalis foram determinadas antes da instrumentação, após a instrumentação e uso das medicações intracanal, por meio de ddPCR.

Isolamento do DNA genômico e medição da concentração do DNA O DNA foi extraído usando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante. Antes do isolamento do DNA, as amostras (os tubos com pontas de papel) foram digeridas a 50-60°C POR vortex por 30s a cada 10 min, a fim de garantir a desagregação de todas as bactérias na solução de PBS. Em seguida, os cones de papel foram removidos assepticamente da suspensão e a suspensão bacteriana foi peletizada por centrifugação por 10 min a 5000 g. O sedimento foi então ressuspenso em 180 µl de tampão ATL fornecido pelo QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha) e foram adicionados 20 µl de proteinase K (20 mg/ml). As amostras foram incubadas por 3 h a 56°C. Posteriormente, o DNA genômico bacteriano total foi isolado de acordo com o protocolo do QIAamp DNA Mini Kit. O volume final da solução de DNA de cada amostra foi de 150 μL e foi levado em consideração durante o cálculo. A concentração de DNA (absorvância a 260 nm) foi determinada com um espectrofotômetro (Promega Quantifluor).

Amplificação dos genes 16S rRNA Primers para os genes Universal e Enterococcus 16S rRNA foram desenhados neste estudo. Após a extração de DNA de amostras com QIAamp DNA Mini Kit, 700-800 pb de sequências de 16S rRNA foram amplificadas usando o iniciador direto universal E8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') e o iniciador reverso universal E1115R (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. O volume final das reações de PCR para cada cepa bacteriana isolada foi ajustado para 25 µl. As reações de amplificação dos genes 16S rRNA foram realizadas com as seguintes condições. 1 ciclo de pré-desnaturação a 95°C por 3 minutos, 35 ciclos de 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos e 72°C por 30 segundos que continuam com uma etapa de extensão final a 72°C por 10 minutos .

Os produtos da PCR foram analisados ​​por eletroforese utilizando gel de agarose 2% (contendo brometo de etídio) em tampão Tris/BoratE/EDTA (TBE), sendo os géis analisados ​​sob luz ultravioleta (140V por 20 minutos). Suas imagens foram visualizadas sob iluminação ultravioleta. Além disso, o controle e otimização dos primers a serem utilizados para ddPCR também foi feito na PCR convencional.

Purificação e Sequenciamento do Gene 16S rRNA Após as reações de PCR, a purificação dos produtos de PCR é feita por hidrólise do excesso de primers e nucleotídeos com ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) contendo as enzimas Exonuclease I e Fosfatase Alcalina. 2 µl de ExoSap-IT foram misturados com 5 µl de produto de PCR para cada amostra. A reação ExoSap é realizada a 37°C por 15 minutos (ativação enzimática) seguidos de 15 minutos (inativação) a 80°C. As reações de sequenciamento foram realizadas usando o kit de sequenciamento de ciclo Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). As reações foram realizadas de acordo com o manual do kit para todas as cepas isoladas.

Após a purificação dos produtos com Exosap, a reação de sequência foi realizada com BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) nas seguintes condições. Após a sequência de PCR, os produtos BigDye foram purificados pelo método do cólon. O kit Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up (Zymo Research, EUA) foi usado para este processo. Todas as amostras foram purificadas de acordo com o protocolo fornecido no kit e executadas no analisador genético 3130XL.

Droplet Digital PCR (ddPCR) O Droplet Digital PCR (ddPCR) foi realizado utilizando primers desenhados de acordo com a região 16S rRNA específica para bactérias totais e espécies de Enterococcus faecalis, após sequenciamento, quantificação absoluta das espécies bacterianas encontradas na amostra de ponta de papel. Os pares de primers eram 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' e 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 para bactérias totais e ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' e ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3' pares de primers para Enterococcus Faecalis. Na reação de PCR, amplicons amplificados com pares de primers não marcados foram analisados ​​por marcação com corante Eva-Green. Para quantificação absoluta de Enterococcus e 16S rRNA total, a PCR foi realizada com dois pares de primers da mesma amostra. 20 µL de mistura de PCR contendo 10 µL de 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, cat. não. 1864034), 9 µL de água livre de nuclease, 0,25 µL de primer direto e reverso e 2 ng de DNA de cada amostra. 60◦C por 1 min e duas etapas finais a 4◦C por 5 minutos e 90◦C por 5 minutos com uma manutenção infinita de 4◦C. Após a conclusão da PCR, a placa selada foi transferida para o suporte de placa do QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, cat. não. 1864003).