扫描激光激活系统功效的定量评估

资格标准 研究人群由 20 名患者（年龄 19-66 岁）组成，他们在伊斯坦布尔 Medipol 大学牙科学校的牙髓诊所就诊，对具有根尖周炎病变的牙齿进行非手术牙髓治疗。 本研究包括 20 颗表现出慢性根尖周炎病变的临床和影像学证据的牙齿。 放射学上，根尖透光区的直径范围为 2 至 7 毫米。 患有根尖周炎的牙齿需要治疗。 选定的牙齿具有足够的牙冠结构，可以用橡皮障充分隔离，并且没有牙周袋或深度超过 4 毫米的附着层。 排除标准也适用，如下：在过去 3 个月内接受过抗生素治疗或患有任何全身疾病的患者的牙齿，无法用橡皮障正确隔离的牙齿，没有冠状动脉封闭的牙齿，有牙周袋的牙齿深度 >4 毫米；和牙冠/牙根折裂的牙齿。 每个患者只包括一颗牙齿。

根管治疗程序和取样 在整个牙髓再治疗过程中使用橡皮障和无菌技术。 去除菌斑、橡皮障隔离后，用3%过氧化氢清洗手术区，用2.5% NaOCl溶液消毒。 然后，移除所有冠修复体、桩和龋齿缺损，并在根管充填物适当暴露时完成入路准备。 然后用2.5% NaOCl再次对牙齿（包括髓室）、夹具和相邻的橡皮障进行消毒，然后用10%硫代硫酸钠灭活以避免干扰细菌学取样。 无菌对照样品 (SR1) 使用带有可弹出头的无菌 Omni Swab（Whatman FTA，Sigma-Aldrich）从牙齿表面采集。 将纸点转移到含有磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液的冷冻管中，储存于 -20°C。 在每种情况下，都对单个根管进行采样，以便将微生物评估限制在单个生态环境中。 在多根牙中，选择具有根尖周病变的牙根。 如果所有牙根都有根尖周病变，则选择较宽的根管。

使用根尖定位器（Raypex6；VDW GmbH，慕尼黑，德国）确定距根尖孔短 1 毫米的工作长度 (WL)，然后拍摄根尖周 X 光片以确保去除所有填充材料。 用无菌盐水溶液冲洗以去除任何残留物质并在样品收集之前润湿管道。 接下来，在根管内充满生理盐水，在 WL 处放置一个小型手持器械，用于轻轻锉根管壁。 初始微生物样本 (S1) 从根管中取出，无菌纸点连续放置在 WL 处。 将三个无菌纸尖插入根管内进行取样。 每个纸点留在管内约 1 分钟。 纸尖和没有手柄的牙髓手持器械都被转移到含有 300 μl PBS 溶液的冷冻管中，储存于 -20°C。 样品被转移到基因分析实验室进行冷链进一步分析。

使用 ProTaper Next 预备根管； Dentsply-Sirona、Ballaigues、İsviçre 锉刀并用 2.5% NaOCl 灌溉。 根管根尖扩大至工作长度的 35 号 (AS35)。 在每次器械更换之间，使用 30 号侧通气针头用 5 毫升 2.5% NaOCl 溶液冲洗根管，针头距离工作长度 1 至 2 毫米。 因此，总共使用了 30 mL 的冲洗液。 仪器完成后，用 2 mL 17% EDTA 去除污迹层，将其留在根管中 3 分钟，然后用 2.5% NaOCl。 用无菌纸尖擦干根管并用 2 ml 10% 硫代硫酸钠冲洗 1 分钟以灭活 NaOCl 溶液。 接下来，如 S1 所述，从根管中取出样本 (S2)。 此后，如下所述搅动/活化NaOCl。

扫描组：将扫描光纤尖端（25 µs 超短双脉冲模式-自动扫描模式）插入 Er:YAG 激光源（2,940 nm，每脉冲 20 mJ，15 Hz，0.3 W 功率和 50 µs 脉冲频率）。 放置在通路腔中的 SWEEPS 尖端保持在稳定位置，并在 SWEEPS 模式下使用与 PIPS 组所述相同的方法和相同数量的冲洗溶液进行激活。

PUI 组：通过将超声波尖端（IRRI S 21/25；VDW，慕尼黑，德国）适配到超声波设备（VDW Ultra；VDW，慕尼黑，德国）来使用冲洗溶液。 尖端总共被激活三次，每个周期持续 20 秒，涉及使用 1 ml 3% NaOCl。 然后，如上所述将 2 ml 17% EDTA 溶液活化 1 分钟。 超声工作尖置于工作长度后 2 mm 处，不接触根管壁。

最后，将两组根管干燥并用2 mL 10%硫代硫酸钠冲洗1 min。 激活后样本 (S3) 的获取方式与收集激活前样本的方式相同，并送去进行 PCR 分析。 根管治疗完成后，使用牙胶的侧向浓缩进行牙根充填。 用复合树脂修复通路腔，并拍摄最终的射线照片。 所有根管和微生物取样程序均由一位经验丰富的牙髓医生执行。 通过液滴数字聚合酶链反应 (ddPCR)，在使用仪器之前、使用仪器和使用灌溉激活系统后，确定总细菌负荷以及粪肠球菌的数量。

总细菌载量以及粪肠球菌的量在仪器化之前、仪器化之后和使用管内药物时通过 ddPCR 进行测定。

基因组 DNA 分离和 DNA 浓度测量 按照制造商推荐的方案，使用 QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德国）提取 DNA。 在 DNA 分离之前，样品（带纸尖的试管）在 50-60°C 下每 10 分钟涡旋消化 30 秒，以确保所有细菌分解到 PBS 溶液中。 然后，从悬浮液中无菌去除纸尖，并通过在 5000 g 下离心 10 分钟使细菌悬浮液沉淀。 然后将沉淀重悬于由 QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN GmbH，Hilden，Germany）提供的 180 µl 缓冲液 ATL 中，并添加 20 µl 蛋白酶 K（20 mg/ml）。 样品在 56°C 下孵育 3 小时。 随后，根据 QIAamp DNA Mini Kit 的方案分离总细菌基因组 DNA。 每个样品的 DNA 溶液的最终体积为 150 μL，并在计算过程中考虑在内。 用分光光度计（Promega Quantifluor）测定 DNA 浓度（260 nm 处的吸光度）。

16S rRNA 基因的扩增 本研究设计了通用和肠球菌 16S rRNA 基因的引物。 使用 QIAamp DNA Mini Kit 提取样品 DNA 后，使用通用 E8F 正向引物 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和通用 E1115R 反向引物 (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 扩增 700-800 bp 的 16S rRNA 序列59. 将每个分离的细菌菌株的 PCR 反应的最终体积调整为 25 µl。 16S rRNA基因的扩增反应在以下条件下进行。 1 个 95°C 3 分钟预变性循环，35 个 95°C 30 秒、55°C 30 秒和 72°C 30 秒的循环，最后的延伸步骤是 72°C 10 分钟.

使用在 Tris/BoratE/EDTA (TBE) 缓冲液中的 2% 琼脂糖凝胶（含有溴化乙锭）通过电泳分析 PCR 产物，凝胶在紫外光下（在 140V 下 20 分钟）进行分析。 他们的图像在紫外线照射下可视化。 此外，用于ddPCR的引物的控制和优化也在常规PCR中进行。

16S rRNA 基因的纯化和测序 PCR 反应后，通过使用含有核酸外切酶 I 和碱性磷酸酶的 ExoSap-IT（Thermo，PN：78201.1.ML）水解多余的引物和核苷酸来纯化 PCR 产物。每个样品将 2 µl ExoSap-IT 与 5 µl PCR 产物混合。 ExoSap 反应在 37 °C 下进行 15 分钟（酶活化），然后在 80 °C 下进行 15 分钟（失活）。 使用 Bigdye™ Terminator v3.1 循环测序试剂盒 (Thermo) 进行测序反应。 根据所有分离菌株的试剂盒手册进行反应。

用Exosap纯化产物后，在以下条件下用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo)进行测序反应。 序列PCR后，BigDye产物通过结肠法纯化。 Zymo ZR DNA 测序清理试剂盒（Zymo Research，美国）用于此过程。 所有样品均按照试剂盒中提供的方案进行纯化，并在 3130XL 基因分析仪上执行。

微滴式数字 PCR (ddPCR) 微滴式数字 PCR (ddPCR) 是使用根据对总细菌和粪肠球菌物种特异的 16S rRNA 区域设计的引物进行的，在测序后，对纸点样本中发现的细菌物种进行绝对定量。 引物对为 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' 和 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3（用于总细菌）和 ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' 和 ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3' 粪肠球菌的引物对。 在 PCR 反应中，通过用 Eva-Green 染料标记来分析用未标记的引物对扩增的扩增子。 对于肠球菌和总 16S rRNA 的绝对定量，使用来自同一样本的两个引物对进行 PCR。 20 µL PCR 混合物，包含 10 µL 2X ddPCR EvaGreen Supermix（Bio-Rad，猫。 不。 1864034)、9 µL 无核酸酶水、0.25 µL 正向和反向引物以及来自每个样品的 2 ng DNA 热循环条件为：95°C 5 分钟，然后 40 个 95°C 循环 30 秒和60°C 1 分钟，最后两个步骤在 4°C 5 分钟和 90°C 5 分钟，4°C 无限保持。 PCR 完成后，将密封的板转移到 QX200 液滴读数器（Bio-Rad，目录号 不。 1864003）。