Valutazione quantitativa dell'efficacia dei sistemi di attivazione laser Sweeps

Criteri di ammissibilità La popolazione dello studio era composta da 20 pazienti (di età compresa tra 19 e 66 anni) che si presentavano alla clinica endodontica presso la Istanbul Medipol University Dental School, per il trattamento endodontico non chirurgico di denti con lesioni parodontali apicali. In questo studio sono stati inclusi 20 denti che mostravano evidenza clinica e radiografica di lesioni da parodontite apicale cronica. Radiograficamente, il diametro della radiotrasparenza periapicale variava da 2 a 7 mm. I denti con parodontite apicale avevano richiesto un trattamento. I denti selezionati avevano una struttura della corona sufficiente per un adeguato isolamento con una diga di gomma e mostravano un'assenza di tasche parodontali o livello di attacco più profondo di 4 mm. Sono stati applicati anche i criteri di esclusione, come segue: denti di pazienti che avevano ricevuto antibiotici nei 3 mesi precedenti o che presentavano una malattia generale, denti che non potevano essere adeguatamente isolati con la diga di gomma, denti con assenza di sigillatura coronarica, denti con tasca parodontale profondità >4mm; e denti con frattura della corona/radice. Per ogni paziente è stato incluso un solo dente.

Procedure di trattamento del canale radicolare e campionamento La diga di gomma e una tecnica asettica sono state utilizzate durante il ritrattamento endodontico. Dopo la rimozione della placca e l'isolamento della diga di gomma, il campo operatorio è stato pulito con perossido di idrogeno al 3% e disinfettato con una soluzione di NaOCl al 2,5%. Quindi, tutti i restauri coronali, perni e difetti cariosi sono stati rimossi e la preparazione dell'accesso è stata completata quando l'otturazione del canale radicolare è stata correttamente esposta. Successivamente, il dente (compresa la camera pulpare), il morsetto e la diga di gomma adiacente sono stati nuovamente disinfettati con NaOCl al 2,5%, seguita da inattivazione con tiosolfato di sodio al 10% per evitare interferenze con il campionamento batteriologico. I campioni di controllo di sterilità (SR1) sono stati prelevati dalla superficie del dente con un Omni Swab sterile (Whatman FTA, Sigma-Aldrich) con una testa eiettabile. I punti di carta sono stati trasferiti in criotubi contenenti una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) conservata a -20°C. In ogni caso, è stato campionato un singolo canale radicolare per limitare la valutazione microbica a un singolo ambiente ecologico. Nei denti con più radici è stata selezionata la radice con la lesione periapicale. Se erano presenti lesioni periapicali in tutte le radici, veniva selezionato il canale più largo.

La lunghezza di lavoro (WL) è stata stabilita 1 mm prima del forame apicale con un localizzatore apicale (Raypex6; VDW GmbH, Monaco, Germania), quindi sono state eseguite radiografie periapicali per garantire che tutto il materiale di riempimento fosse rimosso. L'irrigazione con soluzione fisiologica sterile è stata eseguita per rimuovere eventuali residui di materiale e per inumidire il canale prima della raccolta del campione. Successivamente, il canale è stato lasciato riempito di soluzione fisiologica e un piccolo strumento manuale è stato posizionato in corrispondenza del WL e utilizzato per limare delicatamente le pareti del canale. Un campione microbiologico iniziale (S1) è stato prelevato dal canale radicolare con punti di carta sterili posizionati consecutivamente al WL. Tre punti di carta sterili sono stati inseriti nel canale radicolare per il campionamento. Ogni punto di carta è stato lasciato nel canale per circa 1 minuto. Sia le punte di carta che lo strumento endodontico manuale, senza manico, sono stati trasferiti in criotubi contenenti 300 μl di soluzione PBS conservata a -20°C. I campioni sono stati trasferiti al laboratorio di analisi genetiche per ulteriori analisi nella catena del freddo.

I canali radicolari sono stati preparati utilizzando ProTaper Next; Lime Dentsply-Sirona, Ballaigues, İsviçre e irrigate con NaOCl al 2,5%. I canali sono stati allargati apicalmente alla misura 35 (AS35) alla lunghezza di lavoro. Tra ogni cambio di strumento, il canale radicolare è stato irrigato con 5 ml di soluzione di NaOCl al 2,5% utilizzando un ago con sfiato laterale calibro 30, che è stato posizionato da 1 a 2 mm al di sotto della lunghezza di lavoro. Pertanto, è stato utilizzato un totale di 30 mL della soluzione di irrigazione. Dopo che la strumentazione è stata completata, lo smear layer è stato rimosso con 2 mL di EDTA al 17%, che è stato lasciato nel canale per 3 minuti, seguito da NaOCl al 2,5%. Il canale radicolare è stato asciugato con punte di carta sterili e lavato con 2 ml di tiosolfato di sodio al 10% per 1 minuto per inattivare la soluzione di NaOCl. Successivamente, è stato prelevato un campione (S2) dai canali come descritto per S1. Successivamente, l'NaOCl è stato agitato/attivato come descritto di seguito.

Gruppo Sweeps: la punta della fibra SWEEPS (modalità a doppio impulso ultracorto da 25 μs-modalità Auto SWEEPS) è stata inserita nella sorgente laser Er:YAG (2.940 nm, 20 mJ per impulso, 15 Hz, 0,3 W di potenza e 50 μs di impulso frequenza). La punta SWEEPS posizionata nella cavità di accesso è stata mantenuta in una posizione stabile e l'attivazione è stata eseguita in modalità SWEEPS utilizzando lo stesso metodo con la stessa quantità di soluzioni di irrigazione descritte per il gruppo PIPS.

Gruppo PUI: la soluzione di irrigazione è stata utilizzata adattando una punta a ultrasuoni (IRRI S 21/25; VDW, Monaco, Germania) a un dispositivo a ultrasuoni (VDW Ultra; VDW, Monaco, Germania). La punta è stata attivata per un totale di tre volte, con ogni ciclo della durata di 20 s e che prevedeva l'uso di 1 ml di NaOCl al 3%. Quindi, 2 ml di soluzione EDTA al 17% sono stati attivati ​​per 1 minuto come descritto sopra. La punta ad ultrasuoni è stata posizionata 2 mm dietro la lunghezza di lavoro senza toccare le pareti del canale.

Infine, i canali in entrambi i gruppi sono stati asciugati e risciacquati con 2 mL di tiosolfato di sodio al 10% per 1 minuto. Il campione post attivazione (S3) è stato ottenuto nello stesso modo in cui il campione pre-attivazione è stato raccolto e inviato per l'analisi PCR. Il completamento del trattamento del canale radicolare è proseguito con l'otturazione radicolare mediante condensazione laterale della guttaperca. Le cavità di accesso sono state restaurate con resina composita ed è stata eseguita una radiografia finale. Tutte le procedure di campionamento del canale radicolare e microbico sono state eseguite da un unico endodontista esperto. La carica batterica totale e la quantità di Enterococcus faecalis sono state determinate prima della strumentazione, dopo la strumentazione e l'uso dei sistemi di attivazione dell'irrigazione, mediante la reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (ddPCR).

La carica batterica totale e la quantità di Enterococcus faecalis sono state determinate prima della strumentazione, dopo la strumentazione e l'uso dei medicamenti intracanali, mediante ddPCR.

Isolamento del DNA genomico e misurazione della concentrazione del DNA Il DNA è stato estratto utilizzando il kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Germania) seguendo il protocollo raccomandato dal produttore. Prima dell'isolamento del DNA, i campioni (le provette con punti di carta) sono stati digeriti a 50-60°C vortexando per 30 secondi ogni 10 minuti per garantire la disaggregazione di tutti i batteri nella soluzione PBS. Successivamente, le punte di carta sono state rimosse asetticamente dalla sospensione e la sospensione batterica è stata pellettizzata mediante centrifugazione per 10 minuti a 5000 g. Il pellet è stato quindi risospeso in 180 µl di tampone ATL fornito da QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germania) e sono stati aggiunti 20 µl di proteinasi K (20 mg/ml). I campioni sono stati incubati per 3 ore a 56°C. Successivamente, il DNA genomico batterico totale è stato isolato secondo il protocollo del kit QIAamp DNA Mini. Il volume finale della soluzione di DNA di ciascun campione era di 150 μL ed è stato preso in considerazione durante il calcolo. La concentrazione del DNA (assorbanza a 260 nm) è stata determinata con uno spettrofotometro (Promega Quantifluor).

Amplificazione dei geni 16S rRNA In questo studio sono stati progettati i primer per i geni 16S rRNA Universal ed Enterococcus. Dopo l'estrazione del DNA dei campioni con il kit QIAamp DNA Mini, 700-800 bp di sequenze di rRNA 16S sono state amplificate utilizzando il primer forward E8F universale (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') e il primer reverse E1115R universale (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. Il volume finale delle reazioni PCR per ciascun ceppo batterico isolato è stato regolato a 25 µl. Le reazioni di amplificazione dei geni 16S rRNA sono state eseguite con le seguenti condizioni. 1 ciclo di predenaturazione a 95°C per 3 minuti, 35 cicli di 95°C per 30 secondi, 55°C per 30 secondi e 72°C per 30 secondi che proseguono con una fase finale di estensione a 72°C per 10 minuti .

I prodotti della PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi utilizzando gel di agarosio al 2% (contenente bromuro di etidio) in tampone Tris/BoratE/EDTA (TBE), con i gel analizzati sotto luce ultravioletta (a 140 V per 20 minuti). Le loro immagini sono state visualizzate sotto illuminazione ultravioletta. Inoltre, il controllo e l'ottimizzazione dei primer da utilizzare per ddPCR è stato effettuato anche nella PCR convenzionale.

Purificazione e sequenziamento del gene 16S rRNA Dopo le reazioni di PCR, la purificazione dei prodotti di PCR viene eseguita idrolizzando i primer ei nucleotidi in eccesso con ExoSap-IT (Thermo, PN: 78201.1.ML) contenente gli enzimi esonucleasi I e fosfatasi alcalina. 2 µl di ExoSap-IT sono stati miscelati con 5 µl di prodotto PCR per ciascun campione. La reazione ExoSap viene eseguita a 37 °C per 15 minuti (attivazione dell'enzima) seguiti da 15 minuti (inattivazione) a 80 °C. Le reazioni di sequenziamento sono state eseguite utilizzando il kit di sequenziamento del ciclo Bigdye™ Terminator v3.1 (Thermo). Le reazioni sono state eseguite secondo il manuale del kit per tutti i ceppi isolati.

Dopo la purificazione dei prodotti con Exosap, la reazione di sequenza è stata eseguita con BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo) nelle seguenti condizioni. Dopo la sequenza PCR, i prodotti BigDye sono stati purificati con il metodo del colon. Per questo processo è stato utilizzato il kit di pulizia del sequenziamento del DNA Zymo ZR (Zymo Research, USA). Tutti i campioni sono stati purificati secondo il protocollo fornito nel kit ed eseguiti sull'analizzatore genetico 3130XL.

Droplet Digital PCR (ddPCR) La Droplet Digital PCR (ddPCR) è stata eseguita utilizzando primer progettati secondo la regione rRNA 16S specifica per i batteri totali e le specie di Enterococcus faecalis, dopo il sequenziamento, la quantificazione assoluta dalle specie batteriche trovate nel campione di carta. Le coppie di primer erano 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' e 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 per i batteri totali e ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' e ENT-R-5'-GCCATGCGGCATAAACTG -3' coppie di primer per Enterococcus Faecalis. Nella reazione PCR, gli ampliconi amplificati con coppie di primer non marcati sono stati analizzati mediante etichettatura con colorante Eva-Green. Per la quantificazione assoluta di Enterococcus e del 16S rRNA totale, la PCR è stata eseguita con due coppie di primer dello stesso campione. 20 µL di PCR mix contenente 10 µL di 2X ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, cat. NO. 1864034), 9 µL di acqua priva di nucleasi, 0,25 µL di forward primer e reverse primer e 2 ng di DNA da ciascun campione Le condizioni del ciclo termico erano: 95◦C per 5 min, quindi 40 cicli di 95◦C per 30 s e 60◦C per 1 minuto e due passaggi finali a 4◦C per 5 minuti e 90◦C per 5 minuti con una tenuta infinita a 4◦C. Dopo che la PCR è stata completata, la piastra sigillata è stata trasferita nel portapiastre del QX200 Droplet Reader (Bio-Rad, cat. NO. 1864003).