Sweeps-laseraktivointijärjestelmien tehokkuuden kvantitatiivinen arvio

Kelpoisuuskriteerit Tutkimuspopulaatio koostui 20 potilaasta (ikä 19-66 vuotta), jotka saapuivat Istanbulin Medipolin yliopiston hammaslääketieteen koulun endodontian klinikalle apikaalisten parodontiittivaurioiden hampaiden ei-kirurgiseen endodontiaan. Tähän tutkimukseen otettiin mukaan 20 hammasta, joilla oli kliinisiä ja radiografisia todisteita kroonisista apikaalisista parodontiittivaurioista. Radiografisesti periapikaalisen radiolukeuden halkaisija vaihteli välillä 2-7 mm. Hampaat, joilla oli apikaalinen parodontiitti, olivat vaatineet hoitoa. Valituissa hampaissa oli tarpeeksi kruunurakennetta riittävään eristykseen kumipadolla, ja niissä ei havaittu parodontaalitaskuja tai kiinnitystasoa syvemmällä kuin 4 mm. Poissulkemiskriteereitä sovellettiin myös seuraavasti: hampaat potilailta, jotka olivat saaneet antibiootteja viimeisen 3 kuukauden aikana tai joilla oli jokin yleinen sairaus, hampaat, joita ei voitu eristää kunnolla kumiemolla, hampaat, joissa ei ollut sepelvaltimon tiivistettä, hampaat, joissa on periodontaalitasku syvyys > 4 mm; ja hampaat, joissa on kruunun/juuren murtuma. Jokaiselta potilaalta oli mukana vain yksi hammas.

Juurihoitotoimenpiteet ja näytteenotto Kumipatoa ja aseptista tekniikkaa käytettiin koko endodontian uudelleenhoidon ajan. Plakin poiston ja kumipadon eristämisen jälkeen leikkausalue puhdistettiin 3 % vetyperoksidilla ja desinfioitiin 2,5 % NaOCl-liuoksella. Sitten kaikki koronaaliset täytteet, tolpat ja kariesvauriot poistettiin ja pääsyn valmistelu saatiin päätökseen, kun juurikanavatäyte oli kunnolla esillä. Jälkeenpäin hammas (mukaan lukien massakammio), puristin ja viereinen kumisulku desinfioitiin jälleen 2,5-prosenttisella NaOCl:lla, mitä seurasi inaktivointi 10-prosenttisella natriumtiosulfaatilla bakteriologisen näytteenoton häiritsemisen välttämiseksi. Steriilisyyskontrollinäytteet (SR1) otettiin hampaan pinnalta steriilillä Omni Swab -puikolla (Whatman FTA, Sigma-Aldrich), jossa oli irrotettava pää. Paperikärjet siirrettiin kryoputkiin, jotka sisälsivät fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), jota säilytettiin -20 °C:ssa. Kussakin tapauksessa otettiin näyte yhdestä juurikanavasta mikrobiarvioinnin rajoittamiseksi yhteen ekologiseen ympäristöön. Monijuurisissa hampaissa valittiin juuri, jossa oli periapikaalinen vaurio. Jos kaikissa juurissa oli periapikaalisia vaurioita, valittiin leveämpi kanava.

Työpituus (WL) määritettiin 1 mm lyhyemmäksi apikaalisesta aukosta huippupaikantimella (Raypex6; VDW GmbH, München, Saksa), ja sitten otettiin periapikaaliset röntgenkuvat sen varmistamiseksi, että kaikki täytemateriaali oli poistettu. Kastelu steriilillä suolaliuoksella suoritettiin jäljellä olevien materiaalien poistamiseksi ja kanavan kostuttamiseksi ennen näytteenottoa. Seuraavaksi kanava jätettiin täytetyksi suolaliuoksella ja pieni käsiinstrumentti asetettiin WL:ään ja sitä käytettiin viilaamaan varovasti kanavan seinämiä. Ensimmäinen mikrobiologinen näyte (S1) otettiin juurikanavasta steriileillä paperipisteillä, jotka sijoitettiin peräkkäin WL: hen. Kolme steriiliä paperipistettä asetettiin juurikanavaan näytteenottoa varten. Jokainen paperipiste jätettiin kanavaan noin 1 minuutiksi. Sekä paperipisteet että endodonttinen käsiinstrumentti ilman kahvaa siirrettiin kryoputkiin, jotka sisälsivät 300 μl PBS-liuosta, joita säilytettiin -20 °C:ssa. Näytteet siirrettiin geneettisen analyysin laboratorioon jatkoanalyysiä varten kylmäketjussa.

Juurikanavat valmistettiin käyttämällä ProTaper Next; Dentsply-Sirona, Ballaigues, İsviçre viilat ja kasteltu 2,5 % NaOCl:lla. Kanavat suurennettiin apikaalisesti kokoon 35 (AS35) työpituudella. Jokaisen instrumentin vaihdon välillä juurikanavaa kasteltiin 5 ml:lla 2,5-prosenttista NaOCl-liuosta käyttämällä 30 gaugen sivutuuletettua neulaa, joka sijoitettiin 1-2 mm työpituuden alapuolelle. Tästä syystä huuhteluliuosta käytettiin yhteensä 30 ml. Kun instrumentointi oli suoritettu, sivelykerros poistettiin 2 ml:lla 17-prosenttista EDTA:ta, joka jätettiin kanavaan 3 minuutiksi, mitä seurasi 2,5-prosenttinen NaOCl. Juurikanava kuivattiin steriileillä paperikärillä ja huuhdeltiin 2 ml:lla 10-prosenttista natriumtiosulfaattia 1 minuutin ajan NaOCl-liuoksen inaktivoimiseksi. Seuraavaksi näyte (S2) otettiin kanavista kuten S1:lle on kuvattu. Tämän jälkeen NaOCl:a sekoitettiin/aktivoitiin alla kuvatulla tavalla.

Pyyhkäisyryhmä: SWEEPS-kuitukärki (25 µs ultralyhyt kaksoispulssitila - Auto SWEEPS -tila) lisättiin Er:YAG-laserlähteeseen (2 940 nm, 20 mJ pulssia kohti, 15 Hz, 0,3 W teho ja 50 µs pulssi). taajuus). Pääsyonteloon sijoitettu SWEEPS-kärki pidettiin vakaassa asennossa ja aktivointi suoritettiin SWEEPS-tilassa samalla menetelmällä samalla määrällä kasteluliuoksia, jotka on kuvattu PIPS-ryhmälle.

PUI-ryhmä: Kasteluliuosta käytettiin sovittamalla ultraäänikärki (IRRI S 21/25; VDW, München, Saksa) ultraäänilaitteeseen (VDW Ultra; VDW, München, Saksa). Kärki aktivoitiin yhteensä kolme kertaa, kunkin syklin kestäessä 20 sekuntia ja sisälsi 1 ml 3 % NaOCl:n käytön. Sitten 2 ml 17-prosenttista EDTA-liuosta aktivoitiin 1 minuutin ajan edellä kuvatulla tavalla. Ultraäänikärki asetettiin 2 mm työpituuden taakse koskematta kanavan seiniin.

Lopuksi molempien ryhmien kanavat kuivattiin ja huuhdeltiin 2 ml:lla 10-prosenttista natriumtiosulfaattia 1 minuutin ajan. Aktivaation jälkeinen näyte (S3) saatiin samalla tavalla kuin esiaktivointinäyte kerättiin ja lähetettiin PCR-analyysiä varten. Juurihoitojen viimeistely eteni juuritäytteellä guttaperkan lateraalisella kondensaatiolla. Pääsyontelot palautettiin komposiittihartsilla ja otettiin lopullinen röntgenkuva. Kaikki juurikanava- ja mikrobinäytteenottotoimenpiteet suoritti yksi kokenut endodontti. Bakteerien kokonaismäärät sekä Enterococcus faecalisin määrä määritettiin ennen instrumentointia, instrumentoinnin ja kasteluaktivointijärjestelmien käytön jälkeen pisaradigitaalipolymeraasiketjureaktion (ddPCR) avulla.

Bakteerien kokonaismäärä sekä Enterococcus faecalisin määrä määritettiin ennen instrumentointia, instrumentoinnin ja intrakanaalisten lääkkeiden käytön jälkeen ddPCR:llä.

Genomisen DNA:n eristäminen ja DNA-pitoisuuden mittaus DNA uutettiin käyttämällä QIAamp DNA Mini Kit -sarjaa (Qiagen, Saksa) noudattaen valmistajan suosittelemaa protokollaa. Ennen DNA:n eristämistä näytteet (paperikärkiset putket) digestoitiin 50-60 °C:ssa vorteksoimalla 30 sekunnin ajan 10 minuutin välein kaikkien bakteerien hajoamisen varmistamiseksi PBS-liuokseen. Sen jälkeen paperipisteet poistettiin aseptisesti suspensiosta ja bakteerisuspensio pelletoitiin sentrifugoimalla 10 minuuttia 5000 g:ssä. Pelletti suspendoitiin sitten uudelleen 180 ul:aan puskuri-ATL-puskuria, jonka toimitti QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Saksa) ja lisättiin 20 ui proteinaasi K:ta (20 mg/ml). Näytteitä inkuboitiin 3 tuntia 56 °C:ssa. Tämän jälkeen bakteerien genominen kokonais-DNA eristettiin QIAamp DNA Mini Kitin protokollan mukaisesti. Kunkin näytteen DNA-liuoksen lopullinen tilavuus oli 150 µl ja se otettiin huomioon laskennassa. DNA-konsentraatio (absorbanssi 260 nm:ssä) määritettiin spektrofotometrillä (Promega Quantifluor).

16S-rRNA-geenien monistus Tässä tutkimuksessa suunniteltiin alukkeita Universal- ja Enterococcus 16S-rRNA-geeneille. Näytteiden DNA-uuton jälkeen QIAamp DNA Mini Kit -pakkauksella 700-800 bp 16S-rRNA-sekvenssejä monistettiin käyttämällä universaalia E8F-forward-aluketta (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') ja universaalia E1115R-käänteisaluketta (5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3') 59. Jokaisen eristetyn bakteerikannan PCR-reaktioiden lopullinen tilavuus säädettiin 25 ul:ksi. 16S-rRNA-geenien monistusreaktiot suoritettiin seuraavissa olosuhteissa. 1 esidenaturointijakso 95 °C:ssa 3 minuuttia, 35 sykliä 95 °C:ssa 30 sekuntia, 55 °C:ssa 30 sekuntia ja 72 °C:ssa 30 sekuntia, jotka jatkuvat viimeisellä pidennysvaiheella 72 °C:ssa 10 minuuttia .

PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesilla käyttäen 2-prosenttista agaroosigeeliä (sisältää etidiumbromidia) Tris/BoratE/EDTA (TBE) -puskurissa, ja geelit analysoitiin ultraviolettivalossa (140 V:ssa 20 minuuttia). Heidän kuvat visualisoitiin ultraviolettivalossa. Lisäksi ddPCR:ssä käytettävien alukkeiden ohjaus ja optimointi tehtiin myös tavanomaisessa PCR:ssä.

16S-rRNA-geenin puhdistus ja sekvensointi PCR-reaktioiden jälkeen PCR-tuotteiden puhdistus suoritetaan hydrolysoimalla ylimääräiset alukkeet ja nukleotidit ExoSap-IT:llä (Thermo, PN: 78201.1.ML), joka sisältää eksonukleaasi I- ja alkalifosfataasientsyymejä. 2 ui ExoSap-IT:tä sekoitettiin 5 ul:aan PCR-tuotetta jokaista näytettä kohti. ExoSap-reaktio suoritetaan 37 °C:ssa 15 minuutin ajan (entsyymiaktivaatio), jota seuraa 15 minuuttia (inaktivointi) 80 °C:ssa. Sekvensointireaktiot suoritettiin käyttämällä Bigdye™ Terminator v3.1 -syklin sekvensointisarjaa (Thermo). Reaktiot suoritettiin pakkauksen käsikirjan mukaisesti kaikille eristetyille kannoille.

Kun tuotteet oli puhdistettu Exosapilla, sekvenssireaktio suoritettiin BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit -sarjalla (Thermo) seuraavissa olosuhteissa. Sekvenssi-PCR:n jälkeen BigDye-tuotteet puhdistettiin paksusuolen menetelmällä. Tähän prosessiin käytettiin Zymo ZR DNA Sequencing Clean-up Kit (Zymo Research, USA). Kaikki näytteet puhdistettiin pakkauksessa annetun protokollan mukaisesti ja suoritettiin geneettisellä 3130XL-analysaattorilla.

Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) suoritettiin käyttämällä alukkeita, jotka oli suunniteltu 16S-rRNA-alueen mukaan, joka on spesifinen kokonaisbakteeri- ja Enterococcus faecalis -lajeille, sekvensoinnin jälkeen absoluuttisen kvantifioinnin jälkeen paperipistenäytteestä löydetyistä bakteerilajeista. Alukeparit olivat 16S-F-5'-AGGGAATCTTCSGCAATGGG-3' ja 16S-R-5'-ACGCCCAATAAATCCGGACA-'3 bakteerien kokonaismäärälle ja ENT-F-5'-CGCTTCTTTCCTCCCGAGT-3' ja ENT-R-5'-GCCATATGCGG -3' alukeparit Enterococcus Faecalisille. PCR-reaktiossa amplikonit, jotka oli monistettu merkitsemättömillä alukepareilla, analysoitiin leimaamalla Eva-Green-väriaineella. Enterococcuksen ja kokonais-16S rRNA:n absoluuttista kvantitointia varten suoritettiin PCR kahdella alukeparilla samasta näytteestä. 20 µl PCR-seosta, joka sisältää 10 µl 2X ddPCR EvaGreen Supermixiä (Bio-Rad, kat. ei. 1864034), 9 µl nukleaasivapaata vettä, 0,25 µl sekä forward- että reverse-aluketta ja 2 ng DNA:ta kustakin näytteestä Lämpösykliolosuhteet olivat: 95 ◦ C 5 min, sitten 40 sykliä 95 ◦ C 30 s ja 60 ◦ C 1 minuutin ajan ja kaksi viimeistä vaihetta 4 ◦ C 5 minuutin ajan ja 90 ◦ C 5 minuutin ajan 4 ◦ C äärettömällä pitolla. Kun PCR oli valmis, sinetöity levy siirrettiin QX200 Droplet Readerin (Bio-Rad, kat.) levytelineeseen. ei. 1864003).