후기 난포기 균질 자궁내막의 수용성 평가

피험자 28명의 명백히 건강한 여성, 그들 중 14명은 초음파 균질 에코(그룹 1) 및 다른 14명은 후기 난포 단계에서 "트리플 라인"(그룹 2) 자궁 내막을 가지고 9월 사이에 연구를 위해 우리 부서에 참여했습니다. 2010년과 2011년 11월. 두 그룹의 여성에 대한 포함된 기준은 연구 최소 3개월 전에 자궁 내 장치 또는 경구 피임약을 사용하지 않고 규칙적인 월경 주기(25-35일)를 가진 40세 이하였습니다. 제외 기준은 다낭성 난소 증후군(PCOS), 자궁내막증, 조기 난소 부전(POF) 및 1년 이내 유산 또는 골반 염증성 질환의 병력이 있는 여성이었습니다. 여성의 평균 연령은 31.9±3.7세(범위, 26-39세)였다. 평균 체질량지수는 20.96±2.46이었다. kg/m2 (범위, 17.58-26.04 kg/m2). 규칙적인 월경 주기(25-35일)와 2-11년의 불임 병력이 있는 모든 대상자는 적절한 동의서에 서명했습니다. 이 연구는 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

배란 모니터링 혈액 샘플과 소변 샘플을 채취하여 한 주기 동안 여성을 추적했습니다. 배란은 질 초음파(aloka-1000, UST-985, 5MHz transvaginal probe, aloka Co. Ltd, Tokyo, Japan)로 모니터링하였다. 2개의 자궁내막층의 두께를 측정하였다. 자궁내막 패턴은 Gonen과 Casper가 제안한 분류에 따라 다음과 같이 평가하였다: 중앙 에코선 없이 완전히 균일한 고에코인 자궁내막은 균일한 에코 패턴으로 간주되었고, 삼중선 패턴은 중앙 고에코선이 2개로 둘러싸여 있음 저에코 층. 난포의 성장, 배란 및 황체의 발달은 2면 스캔을 사용하여 모니터링되었습니다. 참가자들은 아침 소변(David ovulation test, Rubio Biotech Co. Ltd., Shantou, China)을 검사하여 LH 급증일을 확인했습니다. LH 서지 일자는 LH 서지가 최고치에 도달했을 때 소변 샘플에서 결정되었으며 혈액 샘플도 수집되었습니다. 주기일은 월경 출혈이 발생한 첫날을 의미합니다. 25~35일 간격의 정상적인 배란 주기를 가진 여성은 빠르면 11일, 늦어도 21일에 배란이 예상됩니다. 말초 혈액 샘플은 LH 급증 당일과 배란 후 6-7일에 정맥 천자에 의해 채취되었습니다. 혈액은 1시간 이내에 원심분리하여 분리하였고 혈청은 LH, FSH, estradiol(E2), progesterone의 농도를 측정할 때까지 -20℃에 보관하였다.

자궁내막 생검 2회의 자궁내막 생검이 각 피험자에서 단일 월경 주기 동안 수행되었습니다. 초기 생검은 배란일 전(후기 난포기)에 시행하였고, 자궁강의 전벽에서 자궁내막 조직을 채취하였다. 후기 생검은 배란일 +7일(중기 또는 착상 과부기)에 시행하였고, 자궁경부 확장 유무에 관계없이 자궁강 후벽에서 자궁내막 큐렛(#4164 prebet)을 이용하여 자궁내막 검체를 채취하였다. , 유전학, pommel, 벨기에). 각 샘플을 세 조각으로 나누고 즉시 고정했습니다. 2.5%(wt/vol) 글루타르알데히드, 0.5% 파라포름알데히드, 0.1 mol/L 수크로스, 0.1 mol/L 나트륨카코딜레이트 및 3mmol/L 염화칼슘(pH, 7.4)을 포함하는 용액에 고정하기 위한 주사 전자 현미경 검사용 샘플 . 면역조직화학을 위한 샘플을 4% 포르말린에 고정시켰다. 투과 전자 현미경 검사를 위한 샘플은 2.5% 글루타르알데히드 비산염으로 고정되었습니다.

주사 전자 현미경 샘플을 0.15mol/L의 sodiumcacodylate와 3mmol/L의 염화칼슘(PH, 7.4)을 포함하는 완충액에서 두 번, 증류수에서 한 번 세척했습니다. 시료는 에탄올(70%, 95% 및 99.5%)의 농도를 증가시키면서 먼저 탈수한 다음 아세톤에서 탈수시켰습니다. 이산화탄소를 이용하여 임계점 건조기에서 건조시켰다. 시편을 장착하고 백금으로 코팅한 후 주사전자현미경(S-3000N, Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하여 검사하였다. 피노포드의 발생 단계를 분류하였다. 자궁내막 표면의 피노포드가 정확히 동시에 발달하지 않기 때문에 피노피드가 자궁내막 표면에 고르게 분포되지 않았기 때문에 본 연구에서는 각 생검 샘플의 5개 필드를 검사하고 피노포드의 발달 및 분포를 분석했습니다. 형태 평가는 다음과 같이 정의되었습니다: 뾰족지 없음, 뾰족지 발달, 완전히 발달된 뾰족지 및 퇴행하는 뾰족지. 반정량적 평가는 다음과 같이 정의하였다:-(0%), +(﹤20%), ++(20-50%) 및 +++(>50%).

면역조직화학 28명의 환자의 56개 생검 샘플을 면역조직화학 분석에 사용했습니다. LIF의 경우 인테그린 αv, VEGF 및 MMP-9 연구 4um 파라핀 포매 섹션을 70℃에서 아세톤에서 20분 동안 탈파라핀 처리했습니다. 내인성 과산화효소는 10분 동안 3% H2O2로 차단되었습니다. 항원 검색은 pH 6.0의 0.01M 구연산 완충액에서 5분 동안 가열하여 끓인 다음 절편을 1:50으로 희석한 특정 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양했습니다. 이 연구에 사용된 항체는 다클론 항체(PAB) LIF, 인테그린 αv, VEGF 및 MMP-9(BA 1239, BA0957, BA0407 및 BA0573, Booster Co Ltd, 중국 우한)였습니다. 절편을 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구고 10% 정상 염소 혈청으로 30분 동안 차단한 다음 염소 항토끼 비오티닐화 면역글로불린(IgG)(SV0002, Booster Co Ltd, Wuhan, China)과 함께 37℃에서 배양했습니다. 30분 동안 integrin β3 연구를 위해 절편을 0.01M citrate buffer(pH6.0)의 95℃에서 끓여서 항원을 hot repair한 후 3% 과산화수소로 10분 동안 배양한 다음 다클론항체 integrin β3(sc-6626, sc-6626, santa, USA)를 4℃에서 밤새 1:100으로 희석했습니다. Polymer Helper(PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, China)를 실온에서 20분 간격으로 첨가하고, Poly Peroxidase-anti-goat IgG(PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, 중국)이 추가되었습니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 세척하고 H2O2(DAB, vitrogen, California, USA) 중 3,3-디아미노벤지딘으로 착색했습니다. 섹션을 마지막으로 물로 세척했습니다. 모든 경우에 1차 특이 항체와의 배양을 생략하여 음성 대조군을 수행하였다. 자궁내막샘 및 표면 상피, 간질 세포에 대한 각각의 다클론 항체의 반응성을 평가하였다. 염색은 등급 시스템을 사용하여 반정량적으로 평가되었습니다. 염색 강도와 염색 세포 수는 0=염색 없음, +/-=약간 염색됨, +=희미한 염색, ++=중간 염색, +++=강한 염색의 척도로 등급을 매겼다. H-점수=ΣPi(i+1)의 공식을 사용하여 계산했습니다. 슬라이드를 식별하기 위해 눈이 먼 한 관찰자가 모든 평가를 수행했습니다. 연구 완료 후, 동일한 관찰자가 반정량적 평가의 재현성을 보장하기 위해 슬라이드를 재검사했습니다.

투과전자현미경 투과전자현미경을 위한 표본을 PBS(pH 7.4) 내 2.5% 글루타르알데히드에 고정하고 1% 오스뮴 테트록사이드에 사후 고정했습니다. Graded ethanol series에서 탈수 후 시편을 propylene oxide에 넣고 Epon에 포매한 후 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하여 투과전자현미경으로 관찰하였다.

통계 분석 사회 과학 통계 패키지(SPSS 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL)를 통계 분석에 사용했습니다. 평균±표준편차는 Student's t-test 분석을 이용하여 평가하였고, 순위자료는 Rank Sum Test(Mann-Whitney test)로 분석하였고, 정성자료는 chi-square test로 분석하였다. 통계적 유의성은 P<0.05(두 꼬리)로 설정되었습니다.