Valutazione della ricettività dell'endometrio omogeneo nella fase follicolare tardiva

Soggetti Ventotto donne apparentemente sane, quattordici delle quali con ecografia ecografica omogenea (gruppo 1) e altre quattordici con endometrio "a tripla linea" (gruppo 2) in fase follicolare tardiva, sono state coinvolte nel nostro Dipartimento per lo studio tra settembre 2010 e novembre 2011. I criteri inclusi per entrambi i gruppi di donne erano ≤40 anni di età, con cicli mestruali regolari (25-35 giorni), senza uso di dispositivi intrauterini o contraccettivi orali almeno 3 mesi prima dello studio. I criteri di esclusione erano donne con sindrome dell'ovaio policistico (PCOS), endometriosi, insufficienza ovarica prematura (POF) e un aborto entro 1 anno o una storia di malattia infiammatoria pelvica. L'età media delle donne era di 31,9±3,7 anni (range, 26-39 anni). L'indice di massa corporea medio era 20,96 ± 2,46 kg/m2 (intervallo, 17,58-26,04 kg/m2). Con un ciclo mestruale regolare (25-35 giorni) e 2-11 anni di infertilità, tutti i soggetti avevano firmato gli appositi moduli di consenso. Lo studio è stato approvato dal nostro comitato etico istituzionale.

Monitoraggio dell'ovulazione Le donne sono state seguite per un ciclo prelevando campioni di sangue e campioni di urina. L'ovulazione è stata monitorata con l'ecografia vaginale (sonda transvaginale aloka-1000, UST-985, 5 MHz, aloka Co. Ltd, Tokyo, Giappone). È stato misurato lo spessore di due strati endometriali. Il pattern endometriale è stato valutato secondo la classificazione proposta da Gonen e Casper come segue: un endometrio interamente omogeneamente iperecogeno senza una linea ecogena centrale è stato considerato come un pattern ecografico omogeneo e il pattern a tripla linea consisteva in una linea iperecogena centrale circondata da due strati ipoecogeni. La crescita dei follicoli, l'ovulazione e lo sviluppo del corpo luteo sono stati monitorati mediante scansioni a due piani. I partecipanti hanno identificato il giorno del picco di LH testando l'urina del mattino (test di ovulazione di David, Rubio Biotech Co. Ltd., Shantou, Cina). Il giorno del picco di LH è stato determinato nei campioni di urina quando il picco di LH ha raggiunto il suo valore più alto in cui sono stati raccolti anche i campioni di sangue. Il giorno del ciclo si riferisce al primo giorno di sanguinamento mestruale. Le donne che hanno cicli ovulatori normali con intervalli di 25-35 giorni dovrebbero ovulare il giorno 11 al più presto e il giorno 21 al più tardi. I campioni di sangue periferico sono stati prelevati mediante puntura venosa il giorno del picco di LH e 6-7 giorni dopo l'ovulazione. Il sangue è stato separato mediante centrifugazione entro 1 ora e il siero è stato conservato a -20 ℃ fino a quando non sono state analizzate le concentrazioni di LH, FSH, estradiolo (E2) e progesterone.

Biopsia endometriale In ogni soggetto sono state eseguite due biopsie endometriali durante un singolo ciclo mestruale. La biopsia precoce è stata eseguita il giorno pre-ovulatorio (fase follicolare tardiva) e i tessuti endometriali sono stati prelevati dalla parete anteriore della cavità uterina. Considerando che la biopsia tardiva è stata eseguita il giorno dell'ovulazione +7 (fase medioluteale o fase della vedova dell'impianto) e il campione endometriale è stato raccolto dalla parete posteriore della cavità uterina con o senza dilatazione della cervice utilizzando una curette endometriale (# 4164 prebet , Genetica, pomo, Belgio). Ogni campione è stato diviso in tre pezzi e subito riparato. Campioni per microscopia elettronica a scansione da fissare in una soluzione contenente 2,5% (peso/volume) di glutaraldeide, 0,5% di paraformaldeide, 0,1 mol/L di saccarosio, 0,1 mol/L di sodiocacodilato e 3 mmol/L di cloruro di calcio (pH, 7,4) . I campioni per l'immunoistochimica sono stati fissati in formalina al 4%. I campioni per la microscopia elettronica a trasmissione sono stati fissati con arseniato di glutaraldeide al 2,5%;

Microscopia elettronica a scansione I campioni sono stati lavati due volte in un tampone contenente 0,15 mol/L di sodiocacodilato e 3 mmol/L di cloruro di calcio (PH, 7,4) e una volta in acqua distillata. I campioni sono stati disidratati prima in concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 95% e 99,5%) e poi in acetone; sono stati essiccati in un essiccatore a punto critico utilizzando anidride carbonica. I campioni sono stati montati, rivestiti con platino ed esaminati utilizzando un microscopio elettronico a scansione (S-3000N, Hitachi, Tokyo, Giappone). La fase di sviluppo del pinopode è stata classificata. Poiché i pinopodi sulla superficie endometriale non si sviluppano esattamente nello stesso momento, i pinopodi non erano distribuiti uniformemente sulla superficie endometriale, quindi, nel nostro studio, abbiamo esaminato cinque campi per ciascun campione di biopsia e analizzato lo sviluppo e la distribuzione dei pinopodi. La valutazione morfologica è stata definita come: assenza di pinopodi, pinopodi in via di sviluppo, pinopodi completamente sviluppati e pinopodi in regressione. La valutazione semi-quantitativa è stata definita come segue:- (0%), + (﹤20%), ++ (20-50%) e +++(>50%).

Immunoistochimica 56 campioni bioptici di 28 pazienti sono stati utilizzati per l'analisi immunoistochimica. Per gli studi LIF, integrina αv, VEGF e MMP-9 sezioni da 4 um incluse in paraffina sono state deparaffinate per 20 minuti in acetone a 70 ℃. La perossidasi endogena è stata bloccata con H2O2 al 3% per 10 min. Il recupero dell'antigene è stato fatto bollire riscaldando per 5 minuti in tampone citrato 0,01 M a pH 6,0, quindi le sezioni sono state incubate durante la notte a 4 ℃ con gli anticorpi specifici che sono stati diluiti a 1:50. Gli anticorpi utilizzati in questo studio erano anticorpi policlonali (PAB) LIF, integrina αv, VEGF e MMP-9 (BA 1239, BA0957, BA0407 e BA0573, Booster Co Ltd, Wuhan, Cina). Le sezioni sono state risciacquate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), bloccate con siero di capra normale al 10% per 30 minuti e quindi incubate con immunoglobuline biotinilate anti-coniglio (IgG) di capra (SV0002, Booster Co Ltd, Wuhan, Cina) a 37 ℃ per 30 min. Per lo studio dell'integrina β3, le sezioni sono state incubate con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti dopo la riparazione a caldo dell'antigene mediante ebollizione a 95 ℃ di tampone citrato 0,01 M (pH6,0), quindi incubate con anticorpi policlonali integrina β3 (sc-6626, santa, USA) diluito a 1:100 durante la notte a 4℃. Polymer Helper (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, China) è stato aggiunto a temperatura ambiente e con un intervallo di 20 min, Poly Peroxidase-anti-goat IgG (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, Cina) è stato aggiunto. I vetrini sono stati quindi lavati in PBS e colorati con 3,3-diaminobenzidina in H2O2 (DAB, vitrogen, California, USA). Le sezioni sono state infine lavate in acqua. In ogni caso è stato eseguito un controllo negativo mediante omissione dell'incubazione con l'anticorpo primario specifico. È stata valutata la reattività di ciascun anticorpo policlonale con ghiandole endometriali ed epitelio superficiale, cellule stromali. La colorazione è stata valutata semiquantitativamente utilizzando un sistema di classificazione. L'intensità della colorazione e il numero di cellule colorate sono stati classificati su una scala di 0 = nessuna colorazione, +/- = poche cellule colorate, + = colorazione debole, ++ = colorazione moderata e +++ = colorazione forte. Per il calcolo è stata utilizzata la formula H-score=ΣPi(i+1). Un osservatore che è stato cieco per identificare le diapositive ha eseguito tutte le valutazioni. Dopo il completamento dello studio, lo stesso osservatore ha riesaminato i vetrini per garantire la riproducibilità della valutazione semiquantitativa.

Microscopia elettronica a trasmissione I campioni per la microscopia elettronica a trasmissione sono stati fissati in glutaraldeide al 2,5% in PBS (pH 7,4) e post-fissati in tetrossido di osmio all'1%. Dopo la disidratazione in una serie graduata di etanolo, i campioni sono stati posti in ossido di propilene e incorporati in Epon, colorati con acetato di uranile e citrato di piombo ed esaminati al microscopio elettronico a trasmissione.

Analisi statistica Lo Statistics Package for Social Science (SPSS 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL) è stato utilizzato per le analisi statistiche. La media ± SD è stata valutata utilizzando l'analisi del t-test di Student, i dati classificati sono stati analizzati con il Rank Sum Test (test di Mann-Whitney) e i dati qualitativi sono stati analizzati con il test chi-quadrato. La significatività statistica è stata fissata a P<0,05 (a due code).