Evaluación de la receptividad del endometrio homogéneo en la fase folicular tardía

Sujetos Veintiocho mujeres aparentemente sanas, catorce de ellas con un eco ecográfico homogéneo (grupo 1) y otras catorce con un endometrio de "triple línea" (grupo 2) en la fase folicular tardía, fueron involucradas en nuestro Departamento para el estudio entre septiembre 2010 y noviembre de 2011. Los criterios incluidos para ambos grupos de mujeres fueron ≤40 años de edad, con ciclos menstruales regulares (25-35 días), sin uso de dispositivos intrauterinos o anticonceptivos orales al menos 3 meses antes del estudio. Los criterios de exclusión fueron mujeres con síndrome de ovario poliquístico (SOP), endometriosis, insuficiencia ovárica prematura (POF) y un aborto dentro de 1 año o antecedentes de enfermedad pélvica inflamatoria. La edad media de las mujeres fue de 31,9±3,7 años (rango, 26-39 años). El índice de masa corporal medio fue de 20,96±2,46 kg/m2 (rango, 17,58-26,04 kg/m2). Con un ciclo menstrual regular (25-35 días) y un historial de infertilidad de 2-11 años, todos los sujetos habían firmado los formularios de consentimiento correspondientes. El estudio fue aprobado por nuestro comité de Ética Institucional.

Seguimiento de la ovulación Las mujeres fueron seguidas durante un ciclo mediante la obtención de muestras de sangre y muestras de orina. La ovulación se monitorizó con ultrasonografía vaginal (aloka-1000, UST-985, sonda transvaginal de 5 MHz, aloka Co. Ltd, Tokio, Japón). Se midió el grosor de dos capas endometriales. El patrón endometrial se evaluó de acuerdo con la clasificación propuesta por Gonen y Casper de la siguiente manera: un endometrio completamente homogéneamente hiperecogénico sin una línea central ecogénica se consideró como un patrón homogéneo de eco y el patrón de triple línea consistió en una línea central hiperecogénica rodeada por dos capas hipoecoicas. El crecimiento de los folículos, la ovulación y el desarrollo del cuerpo lúteo se monitorearon mediante escaneos de dos planos. Los participantes identificaron el día del aumento de LH analizando la orina de la mañana (prueba de ovulación de David, Rubio Biotech Co. Ltd., Shantou, China). El día del pico de LH se determinó en las muestras de orina cuando el pico de LH alcanzó su valor más alto en el que también se recogieron las muestras de sangre. El día del ciclo se refiere al primer día de sangrado menstrual. Se espera que las mujeres que tienen ciclos ovulatorios normales con intervalos de 25 a 35 días ovulen el día 11 como mínimo y el día 21 como máximo. Las muestras de sangre periférica se obtuvieron mediante punción venosa el día del pico de LH y 6-7 días después de la ovulación. La sangre se separó por centrifugación en 1 hora y el suero se almacenó a -20 ℃ hasta que se analizaron las concentraciones de LH, FSH, estradiol (E2) y progesterona.

Biopsia endometrial Se realizaron dos biopsias endometriales durante un solo ciclo menstrual en cada sujeto. La biopsia temprana se realizó el día preovulatorio (fase folicular tardía) y los tejidos endometriales se recolectaron de la pared anterior de la cavidad uterina. Mientras que la biopsia tardía se realizó el día de la ovulación +7 (fase luteínica media o fase viuda de implantación), y la muestra endometrial se recogió de la pared posterior de la cavidad uterina con o sin dilatación del cuello uterino utilizando una cureta endometrial (#4164 prebet , Genética, pomo, Bélgica). Cada muestra se dividió en tres piezas y se fijó inmediatamente. Muestras para microscopía electrónica de barrido para fijar en una solución que contiene glutaraldehído al 2,5 % (peso/vol), paraformaldehído al 0,5 %, sacarosa 0,1 mol/l, cacodilato de sodio 0,1 mol/l y cloruro de calcio 3 mmol/l (pH, 7,4) . Las muestras para inmunohistoquímica se fijaron en formalina al 4%. Las muestras para microscopía electrónica de transmisión se fijaron con arseniato de glutaraldehído al 2,5%;

Microscopía electrónica de barrido Las muestras se lavaron dos veces en un tampón que contenía 0,15 mol/L de cacodilato de sodio y 3 mmol/L de cloruro de calcio (PH, 7,4) y una vez en agua destilada. Las muestras se deshidrataron primero en concentraciones crecientes de etanol (70%, 95% y 99,5%) y luego en acetona; se secaron en un secador de punto crítico usando dióxido de carbono. Las muestras se montaron, se recubrieron con platino y se examinaron utilizando un microscopio electrónico de barrido (S-3000N, Hitachi, Tokio, Japón). Se clasificó la fase de desarrollo del pinópodo. Debido a que los pinópodos en la superficie endometrial no se desarrollan exactamente al mismo tiempo, los pinópodos no se distribuyeron uniformemente sobre la superficie endometrial, por lo tanto, en nuestro estudio, examinamos cinco campos de cada muestra de biopsia y analizamos el desarrollo y la distribución de los pinópodos. La evaluación morfológica se definió como: sin pinópodos, pinópodos en desarrollo, pinópodos completamente desarrollados y pinópodos en regresión. La evaluación semicuantitativa se definió como sigue:- (0%), + (﹤20%), ++ (20-50%) y +++(>50%).

Inmunohistoquímica Se utilizaron 56 muestras de biopsia de 28 pacientes para el análisis inmunohistoquímico. Para los estudios de LIF, integrina αv, VEGF y MMP-9, se desparafinaron secciones de 4 um incluidas en parafina durante 20 min en acetona a 70 ℃. La peroxidasa endógena se bloqueó con H2O2 al 3% durante 10 min. La recuperación del antígeno se hizo hirviendo calentando durante 5 min en tampón de citrato 0,01 M a pH 6,0, y luego las secciones se incubaron durante la noche a 4 ℃ con los anticuerpos específicos que se diluyeron a 1:50. Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron anticuerpos policlonales (PAB) LIF, integrina αv, VEGF y MMP-9 (BA 1239, BA0957, BA0407 y BA0573, Booster Co Ltd, Wuhan, China). Las secciones se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se bloquearon con suero de cabra normal al 10 % durante 30 min y luego se incubaron con inmunoglobulinas biotiniladas (IgG) anti-conejo de cabra (SV0002, Booster Co Ltd, Wuhan, China) a 37 ℃ durante 30 min. Para el estudio de la integrina β3, las secciones se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 min después de la reparación en caliente del antígeno hirviéndolas a 95 ℃ de tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0), luego se incubaron con anticuerpos policlonales contra la integrina β3 (sc-6626, santa, EE. UU.) diluido a 1:100 durante la noche a 4 ℃. Polymer Helper (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, China) a temperatura ambiente y con un intervalo de 20 min, Poly Peroxidase-anti-goat IgG (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, China) fue añadido. Luego, los portaobjetos se lavaron en PBS y se colorearon con 3,3-diaminobencidina en H2O2 (DAB, vitrogen, California, EE. UU.). Las secciones fueron finalmente lavadas en agua. En todos los casos se realizó un control negativo por omisión de la incubación con el anticuerpo específico primario. Se evaluó la reactividad de cada anticuerpo policlonal con glándulas endometriales y epitelio superficial, células estromales. La tinción se evaluó semicuantitativamente usando un sistema de clasificación. La intensidad de la tinción y el número de células teñidas se clasificaron en una escala de 0 = sin tinción, +/- = pocas células teñidas, + = tinción débil, ++ = tinción moderada y +++ = tinción intensa. Se utilizó la fórmula de H-score=ΣPi(i+1) para el cálculo. Un observador que estaba cegado para identificar los portaobjetos realizó todas las evaluaciones. Después de completar el estudio, el mismo observador volvió a examinar los portaobjetos para garantizar la reproducibilidad de la evaluación semicuantitativa.

Microscopía electrónica de transmisión Las muestras para microscopía electrónica de transmisión se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % en PBS (pH 7,4) y se fijaron posteriormente en tetróxido de osmio al 1 %. Después de la deshidratación en una serie graduada de etanol, las muestras se colocaron en óxido de propileno y se incluyeron en Epon, se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión.

Análisis estadístico Se utilizó el paquete estadístico para ciencias sociales (SPSS 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL) para los análisis estadísticos. La media ± SD se evaluó mediante el análisis de la prueba t de Student, los datos clasificados se analizaron con la prueba de suma de rangos (prueba de Mann-Whitney) y los datos cualitativos se analizaron con la prueba de chi-cuadrado. La significación estadística se fijó en P<0,05 (dos colas).