後期卵胞期における均質な子宮内膜の受容性評価

被験者 明らかに健康な女性 28 人、うち 14 人は超音波検査で均一なエコー (グループ 1) を示し、他の 14 人は「トリプルライン」(グループ 2) の卵胞期後期の子宮内膜を示し、9 月から2010 年と 2011 年 11 月。 両方のグループの女性に含まれる基準は、年齢が40歳以下で、月経周期が規則的（25〜35日）で、研究の少なくとも3か月前に子宮内避妊器具または経口避妊薬を使用していないことでした. 除外基準は、多嚢胞性卵巣症候群 (PCOS)、子宮内膜症、早発卵巣不全 (POF)、および 1 年以内の中絶または骨盤内炎症性疾患の既往のある女性でした。 女性の平均年齢は 31.9±3.7 歳 (範囲 26 ～ 39 歳) でした。 平均ボディマス指数は20.96±2.46でした kg/m2 (範囲、17.58-26.04 kg/m2)。定期的な月経周期 (25 ～ 35 日) と 2 ～ 11 年の不妊歴を持つすべての被験者は、適切な同意書に署名していました。 この研究は、私たちの制度倫理委員会によって承認されました。

排卵の監視 血液サンプルと尿サンプルを採取することにより、女性を 1 周期追跡しました。 排卵は、膣超音波検査 (aloka-1000、UST-985、5 MHz 経膣プローブ、aloka Co. Ltd、東京、日本) で監視しました。 2 つの子宮内膜層の厚さを測定しました。 子宮内膜パターンは、Gonen と Casper によって提案された分類に従って次のように評価されました。低エコー層。 卵胞の成長、排卵、および黄体の発達は、2面スキャンを使用して監視されました。 参加者は、朝の尿を検査して LH サージの日を特定しました (David 排卵検査、Rubio Biotech Co. Ltd.、汕頭、中国)。 LHサージの日は、血液サンプルも収集されたLHサージが最高値に達したときに、尿サンプルで決定されました。 周期日とは、月経出血の最初の日を指します。 排卵周期が25～35日の正常な女性は、早くて11日目、遅くて21日目に排卵が予想されます。 末梢血サンプルは、LH サージの日と排卵の 6 ～ 7 日後に静脈穿刺によって得られました。 1時間以内に血液を遠心分離し、LH、FSH、エストラジオール(E2)、プロゲステロンの濃度を測定するまで血清を-20℃で保存した。

子宮内膜生検 2 回の子宮内膜生検が、各被験者の 1 回の月経周期中に実施されました。 初期生検は排卵前の日（卵胞後期）に行い、子宮内膜組織を子宮腔の前壁から採取した。 後期生検は排卵日+7（黄体中期または着床未亡人期）に実施され、子宮内膜サンプルは子宮内膜キュレット（#4164 prebet 、遺伝学、ポンメル、ベルギー）。 各サンプルは 3 つの部分に分割され、すぐに修正されました。 2.5% (wt/vol) グルタルアルデヒド、0.5% パラホルムアルデヒド、0.1 mol/L のスクロース、0.1 mol/L のナトリウムカコジル酸、および 3 mmol/L の塩化カルシウム (pH 7.4) を含む溶液で固定するための走査型電子顕微鏡用サンプル. 免疫組織化学用のサンプルは、4% ホルマリンで固定しました。 透過型電子顕微鏡用のサンプルは、2.5% グルタルアルデヒド砒酸塩で固定しました。

走査型電子顕微鏡法 サンプルを、0.15 mol/L のカコジル酸ナトリウムと 3 mmol/L の塩化カルシウム (PH 7.4) を含むバッファーで 2 回、蒸留水で 1 回洗浄しました。 検体は、最初に増加する濃度のエタノール (70%、95%、および 99.5%) で脱水され、次にアセトンで脱水されました。それらは、二酸化炭素を使用して臨界点乾燥機で乾燥されました。 試料をマウントし、プラチナでコーティングし、走査型電子顕微鏡 (S-3000N、日立、東京、日本) を使用して検査しました。 ピノポードの発達段階を分類した。 子宮内膜表面のピノポードは、ピノポードが子宮内膜表面に均等に分布していないのとまったく同時に発生しないため、この研究では、生検サンプルごとに5つのフィールドを調べ、ピノポードの発生と分布を分析しました。 形態評価は、ピノポードなし、ピノポードの発達中、ピノポードの完全発達、およびピノポードの退行と定義されました。 半定量的評価は、- (0%)、+ (﹤20%)、++ (20-50%) および +++ (>50%) として定義されました。

免疫組織化学 28 人の患者の 56 の生検サンプルを免疫組織化学分析に使用しました。 LIF、インテグリンαv、VEGF、およびMMP-9の研究のために、4μmのパラフィン包埋切片を70℃のアセトンで20分間脱パラフィンしました。 内因性ペルオキシダーゼは、3% H2O2 で 10 分間ブロックされました。 抗原回復は、pH 6.0 の 0.01 M クエン酸緩衝液で 5 分間加熱することにより沸騰させ、その後、切片を 1:50 に希釈した特異的抗体とともに 4℃ で一晩インキュベートしました。 この研究で使用された抗体は、ポリクローナル抗体（PAB）LIF、インテグリンαv、VEGF、およびMMP-9（BA 1239、BA0957、BA0407およびBA0573、Booster Co Ltd、武漢、中国）でした。 切片をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすぎ、10％正常ヤギ血清で30分間ブロックした後、ヤギ抗ウサギビオチン化免疫グロブリン（IgG）（SV0002、Booster Co Ltd、武漢、中国）とともに37℃でインキュベートしました。 30分間。 インテグリンβ3研究のために、0.01Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を95℃で煮沸して抗原を熱修復した後、切片を3％過酸化水素で10分間インキュベートし、ポリクローナル抗体インテグリンβ3（sc-6626、 santa, USA) を 1:100 に希釈し、4℃で一晩保存します。ポリマー ヘルパー (PV-9003、Zhong-Shang Co Ltd、北京、中国) を室温で 20 分間隔で添加し、ポリ ペルオキシダーゼ抗ヤギ IgG (PV-9003、Zhong-Shang Co Ltd、北京、中国）が追加されました。 次いで、スライドをＰＢＳで洗浄し、Ｈ ２ Ｏ ２ 中の３，３－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア、米国）によって着色した。 切片は最後に水で洗浄した。 いずれの場合も、一次特異抗体とのインキュベーションを省略して、陰性対照を実施した。 子宮内膜腺および表面上皮、間質細胞との各ポリクローナル抗体の反応性を評価した。 染色は、等級付けシステムを使用して半定量的に評価されました。 染色強度と染色細胞の数は、0=染色なし、+/- = 染色細胞がほとんどない、+ = かすかな染色、++ = 中程度の染色、および +++ = 強い染色のスケールで等級付けされました。 Ｈスコア＝ΣＰｉ（ｉ＋１）の式を用いて計算した。 スライドを識別できない 1 人の観察者がすべての評価を行いました。 研究の完了後、同じオブザーバーがスライドを再検査して、半定量的評価の再現性を確認しました。

透過型電子顕微鏡 透過型電子顕微鏡用の標本は、PBS (pH 7.4) 中の 2.5% グルタルアルデヒドで固定され、1% 四酸化オスミウムで後固定されました。 段階的なエタノールシリーズで脱水した後、標本をプロピレンオキシドに入れ、エポンに包埋し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡で調べました。

統計分析 社会科学の統計パッケージ (SPSS 13.0; SPSS Inc.、イリノイ州シカゴ) を統計分析に使用しました。 平均値±標準偏差はスチューデントの t 検定の分析を使用して評価し、順位付けされたデータは順位和検定 (Mann-Whitney 検定) で分析し、質的データはカイ 2 乗検定で分析しました。 統計的有意性は P < 0.05 (両側) に設定されました。