卵泡晚期均质子宫内膜的容受性评估

受试者 28 名外表健康的女性，其中 14 名具有超声均匀回声（第 1 组），另外 14 名具有“三线”（第 2 组）子宫内膜处于卵泡晚期，在 9 月期间参与了我们部门的研究2010 年和 2011 年 11 月。 两组女性的纳入标准均为 40 岁以下，月经周期规律（25-35 天），研究前至少 3 个月未使用宫内节育器或口服避孕药。 排除标准为患有多囊卵巢综合征 (PCOS)、子宫内膜异位症、卵巢早衰 (POF) 和 1 年内流产或有盆腔炎病史的女性。 女性的平均年龄为 31.9±3.7 岁（范围 26-39 岁）。 平均体重指数为20.96±2.46 kg/m2（范围，17.58-26.04 kg/m2）。月经周期规律（25-35天），有2-11年不孕史，所有受试者均已签署知情同意书。 该研究得到了我们的机构伦理委员会的批准。

排卵监测通过获取血液样本和尿液样本对女性进行一个周期的跟踪。 用阴道超声检查（aloka-1000、UST-985、5 MHz 经阴道探头，aloka Co. Ltd, Tokyo, Japan）监测排卵。 测量两个子宫内膜层的厚度。 根据 Gonen 和 Casper 提出的分类评估子宫内膜模式如下：没有中心回声线的完全均匀高回声的子宫内膜被认为是均匀回声模式，三线模式由一条中央高回声线组成，被两条线包围低回声层。 通过使用双平面扫描监测卵泡的生长、排卵和黄体的发育。 参与者通过检测晨尿确定 LH 激增的日期（David 排卵测试，Rubio Biotech Co. Ltd.，Shantou，China）。 当 LH 激增达到其最高值时，在尿液样本中确定 LH 激增的日期，同时也收集了血液样本。 周期日是指月经出血的第一天。 正常排卵周期为 25-35 天的女性预计最早在第 11 天排卵，最晚在第 21 天排卵。 在 LH 激增当天和排卵后 6-7 天通过静脉穿刺获取外周血样本。 1小时内离心分离血液，血清于-20℃保存，直至测定LH、FSH、雌二醇（E2）和孕酮的浓度。

子宫内膜活检 在每位受试者的单个月经周期期间进行两次子宫内膜活检。 早期活检在排卵前一天（卵泡晚期）进行，子宫内膜组织采集于宫腔前壁。 而晚期活检是在排卵日+7（黄体中期或着床寡妇期）进行的，子宫内膜样本是使用子宫内膜刮匙（#4164 prebet）从宫腔后壁采集的，有或没有宫颈扩张，遗传学，鞍，比利时）。 每个样品被分成三块并立即固定。 固定在含有 2.5%（重量/体积）戊二醛、0.5% 多聚甲醛、0.1 mol/L 蔗糖、0.1 mol/L 二甲胂酸钠和 3 mmol/L 氯化钙（pH 值，7.4）的溶液中的扫描电子显微镜样品. 用于免疫组织化学的样品固定在 4% 福尔马林中。 透射电镜样品用2.5%戊二醛砷酸盐固定；

扫描电子显微镜 样品在含有 0.15 mol/L 二甲胂酸钠和 3 mmol/L 氯化钙 (PH, 7.4) 的缓冲液中洗涤两次，并在蒸馏水中洗涤一次。 标本首先在浓度逐渐增加的乙醇（70%、95% 和 99.5%）中脱水，然后在丙酮中脱水；它们在临界点干燥器中使用二氧化碳进行干燥。 标本被固定，涂上铂，并使用扫描电子显微镜（S-3000N，日立，东京，日本）进行检查。 对胞饮足的发育阶段进行了分类。 由于子宫内膜表面的胞饮节并不完全同时发育，因此胞饮节在子宫内膜表面的分布不均匀，因此，在我们的研究中，我们检查了每个活检样本的五个视野，并分析了胞饮节的发育和分布。 形态学评价定义为：无胞饮足、发育的胞饮足、完全发育的胞饮足和消退的胞饮足。 半定量评价定义如下：-（0%）、+（﹤20%）、++（20-50%）和+++（>50%）。

免疫组织化学 28 名患者的 56 份活检样本用于免疫组织化学分析。 对于 LIF、整合素 αv、VEGF 和 MMP-9 研究，将 4 um 石蜡包埋的切片在 70℃ 的丙酮中脱石蜡 20 分钟。 内源性过氧化物酶用 3% H2O2 封闭 10 分钟。 抗原修复在pH 6.0的0.01 M柠檬酸盐缓冲液中加热煮沸5 min，然后将切片与按1:50稀释的特异性抗体在4℃孵育过夜。 本研究中使用的抗体是多克隆抗体 (PAB) LIF、整合素 αv、VEGF 和 MMP-9（BA 1239、BA0957、BA0407 和 BA0573，Booster Co Ltd，武汉，中国）。 切片用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，用10%正常山羊血清封闭30分钟，然后与山羊抗兔生物素化免疫球蛋白（IgG）（SV0002，Booster Co Ltd，武汉，中国）37℃孵育30分钟。 对于整合素 β3 研究，通过在 95℃ 的 0.01M 柠檬酸盐缓冲液 (pH6.0) 中煮沸对抗原进行热修复后，将切片与 3% 过氧化氢一起孵育 10 分钟，然后与多克隆抗体整合素 β3 (sc-6626, santa, USA) 1:100 稀释，4℃过夜。 Polymer Helper (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, China) 在室温下以 20 分钟的间隔加入聚过氧化物酶-抗山羊 IgG (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing,中国）加入。 然后将载玻片在 PBS 中洗涤并用 3,3-二氨基联苯胺在 H2O2 中的溶液（DAB，vitrogen，California，USA）着色。 最后用水洗涤切片。 在每种情况下，通过省略与第一特异性抗体的孵育来进行阴性对照。 评估了每种多克隆抗体与子宫内膜腺体和表面上皮、基质细胞的反应性。 通过使用分级系统半定量地评估染色。 染色强度和染色细胞的数量按 0 = 无染色、+/- = 少量染色细胞、+ = 微弱染色、++ = 中度染色和 +++ = 强染色的等级分级。 采用H-score=ΣPi(i+1)的公式进行计算。 一位无法识别载玻片的观察员执行了所有评估。 研究完成后，同一观察者重新检查载玻片以确保半定量评估的可重复性。

透射电子显微镜 用于透射电子显微镜的样品在 PBS (pH 7.4) 中的 2.5% 戊二醛中固定，并在 1% 四氧化锇中后固定。 在梯度乙醇系列中脱水后，将标本置于环氧丙烷中并包埋在 Epon 中，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色并在透射电子显微镜下检查。

统计分析社会科学统计软件包（SPSS 13.0；SPSS Inc.，Chicago，IL）用于统计分析。 均值±标准差采用学生 t 检验分析，排序数据采用秩和检验（Mann-Whitney 检验）分析，定性数据采用卡方检验分析。 统计学显着性设定为P<0.05(双尾)。