Receptivitetsvurdering af homogent endometrium i sen follikelfase

Forsøgspersoner 28 tilsyneladende raske kvinder, fjorten af ​​dem med et ultralydshomogent ekko (gruppe 1) og andre fjorten med en "triple-line" (gruppe 2) endometrium i den sene follikelfase, var involveret i vores afdeling til undersøgelsen mellem september 2010 og november 2011. De inkluderede kriterier for begge grupper af kvinder var ≤40 år med en regelmæssig menstruationscyklus (25-35 dage), uden brug af intrauterint udstyr eller oral prævention mindst 3 måneder før undersøgelsen. Eksklusionskriterier var kvinder med polycystisk ovariesyndrom (PCOS), endometriose, for tidlig ovariesvigt (POF) og en abort inden for 1 år eller en historie med bækkenbetændelse. Kvindernes gennemsnitsalder var 31,9±3,7 år (interval, 26-39 år). Det gennemsnitlige kropsmasseindeks var 20,96±2,46 kg/m2 (interval, 17,58-26,04 kg/m2). Med en regelmæssig menstruationscyklus (25-35 dage) og 2-11 års infertil historie havde alle forsøgspersoner underskrevet de korrekte samtykkeerklæringer. Undersøgelsen blev godkendt af vores institutionelle etiske komité.

Ægløsningsovervågning Kvinderne blev fulgt i én cyklus ved at tage blodprøver og urinprøver. Ægløsningen blev overvåget med vaginal ultralyd (aloka-1000, UST-985, 5 MHz transvaginal sonde, aloka Co. Ltd, Tokyo, Japan). Tykkelsen af ​​to endometrielag blev målt. Endometriemønsteret blev vurderet i henhold til klassificeringen foreslået af Gonen og Casper som følger: et endometrium, der var fuldstændig homogent hyperekkoisk uden en central ekko-linje blev betragtet som et homogent ekkomønster, og triple-line mønster bestod af en central hyperekkoisk linje omgivet af to hypoekkoiske lag. Væksten af ​​follikler, ægløsning og udviklingen af ​​corpus luteum blev overvåget ved hjælp af to-plans scanninger. Deltagerne identificerede dagen for LH-stigningen ved at teste morgenurinen (David ægløsningstest, Rubio Biotech Co. Ltd., Shantou, Kina). Dagen for LH-stigningen blev bestemt i urinprøver, når LH-stigningen nåede sin højeste værdi, hvor blodprøverne også blev opsamlet. Cyklusdagen refererede til den første dag med menstruationsblødning. Kvinder, der har normale ægløsningscyklusser med intervaller på 25-35 dage, forventes tidligst at have ægløsning på dag 11 og senest dag 21. De perifere blodprøver blev opnået ved venepunktur på dagen for LH-stigningen og 6-7 dage efter ægløsning. Blod blev adskilt ved centrifugering inden for 1 time, og serumet blev opbevaret ved -20°C, indtil koncentrationerne af LH, FSH, østradiol (E2) og progesteron blev analyseret.

Endometriebiopsi To endometriebiopsier blev udført i løbet af en enkelt menstruationscyklus i hvert individ. Den tidlige biopsi blev udført på den præ-ovulatoriske dag (sen follikelfase), og endometrievævene blev opsamlet fra den forreste væg af livmoderhulen. Mens den sene biopsi blev udført på ægløsningsdag +7 (midluteal fase eller implantationsenkefase), og endometrieprøven blev opsamlet fra den bageste væg af livmoderhulen med eller uden dilatation af livmoderhalsen ved at bruge en endometrial curette (#4164 prebet) , Genetik, pommel, Belgien). Hver prøve blev delt i tre stykker og straks fikseret. Prøver til scanning elektronmikroskopi til fiksering i en opløsning indeholdende 2,5 % (vægt/vol) glutaraldehyd, 0,5 % paraformaldehyd, 0,1 mol/L saccharose, 0,1 mol/L natriumcacodylat og 3 mmol/L calciumchlorid (pH, 7,4) . Prøver til immunhistokemi blev fikseret i 4% formalin. Prøver til transmissionselektronmikroskopi blev fikseret med 2,5 % glutaraldehydarsenat;

Scanningelektronmikroskopi Prøver blev vasket to gange i en buffer indeholdende 0,15 mol/L natriumcacodylat og 3 mmol/L calciumchlorid (PH, 7,4) og én gang i destilleret vand. Prøverne blev først dehydreret i stigende koncentrationer af ethanol (70 %, 95 % og 99,5 %) og derefter i acetone; de blev tørret i en kritisk punkttørrer ved hjælp af kuldioxid. Prøverne blev monteret, belagt med platin og undersøgt ved hjælp af et scanningelektronmikroskop (S-3000N, Hitachi, Tokyo, Japan). Udviklingsfasen af ​​pinopoden blev klassificeret. Fordi pinopoderne på endometrieoverfladen ikke udvikler sig på nøjagtig samme tidspunkt, var pinopoderne ikke jævnt fordelt over endometrieoverfladen, og derfor undersøgte vi i vores undersøgelse fem felter hver biopsiprøve og analyserede udviklingen og fordelingen af ​​pinopoder. Morfologievalueringen blev defineret som: ingen pinopoder, udviklende pinopoder, fuldt udviklede pinopoder og regresserende pinopoder. Den semikvantitative evaluering blev defineret som følgende:- (0%), + (﹤20%), ++ (20-50%) og +++(>50%).

Immunhistokemi 56 biopsiprøver af 28 patienter blev brugt til immunhistokemisk analyse. Til LIF, integrin αv, VEGF og MMP-9 undersøgelser blev 4 um paraffinindlejrede sektioner afparaffineret 20 minutter i acetone ved 70 ℃. Endogen peroxidase blev blokeret med 3% H2O2 i 10 min. Antigenudvinding kogte ved opvarmning i 5 minutter i 0,01 M citratbuffer ved pH 6,0, og derefter blev sektionerne inkuberet natten over ved 4 ℃ med de specifikke antistoffer, som blev fortyndet ved 1:50. Antistofferne anvendt i denne undersøgelse var polyklonale antistoffer (PAB) LIF, integrin αv, VEGF og MMP-9 (BA 1239, BA0957, BA0407 og BA0573, Booster Co Ltd, Wuhan, Kina). Sektionerne blev skyllet i phosphatpufret saltvand (PBS), blokeret med 10 % normalt gedeserum i 30 minutter og derefter inkuberet med gede-anti-kanin biotinylerede immunoglobuliner (IgG) (SV0002, Booster Co Ltd, Wuhan, Kina) ved 37 ℃ i 30 min. Til integrin β3 undersøgelse blev sektionerne inkuberet med 3% hydrogenperoxid i 10 minutter efter varm reparation af antigen ved kogning ved 95 ℃ af 0,01 M citratbuffer (pH 6,0), derefter inkuberet med polyklonale antistoffer integrin β3 (sc-6626, santa, USA) fortyndet ved 1:100 natten over ved 4 ℃. Polymer Helper (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, Kina) blev tilsat ved stuetemperatur og med et interval på 20 minutter, Poly Peroxidase-anti-ged IgG (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, Kina) blev tilføjet. Objektglassene blev derefter vasket i PBS og farvet med 3,3-diaminobenzidin i H2O2 (DAB, vitrogen, Californien, USA). Sektionerne blev til sidst vasket i vand. I hvert tilfælde blev en negativ kontrol udført ved udeladelse af inkubation med det primære specifikke antistof. Reaktiviteten af ​​hvert polyklonalt antistof med endometriekirtler og overfladeepitel, stromaceller blev vurderet. Farvning blev evalueret semikvantitativt ved anvendelse af et klassificeringssystem. Farvningsintensitet og antallet af farvede celler blev klassificeret på en skala fra 0 = ingen farvning, +/- = få farvede celler, + = svag farvning, ++ = moderat farvning og +++ = kraftig farvning. Formlen for H-score=ΣPi(i+1) blev brugt til beregningen. En observatør, der var blindet for at identificere objektglassene, udførte alle vurderingerne. Efter afslutningen af ​​undersøgelsen genundersøgte den samme observatør objektglassene for at sikre reproducerbarheden af ​​den semikvantitative vurdering.

Transmissionselektronmikroskopi Prøver til transmissionselektronmikroskopi blev fikseret i 2,5 % glutaraldehyd i PBS (pH 7,4) og efterfikseret i 1 % osmiumtetroxid. Efter dehydrering i en gradueret ethanolserie blev prøver anbragt i propylenoxid og indlejret i Epon, farvet med uranylacetat og blycitrat og undersøgt i transmissionselektronmikroskop.

Statistisk analyse Statistics Package for Social Science (SPSS 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL) blev brugt til statistiske analyser. Middelværdien±S.D blev evalueret ved hjælp af analyse af elevens t-test, rangerede data blev analyseret med Rank Sum Test (Mann-Whitney test), og kvalitative data blev analyseret med chi-square test. Statistisk signifikans blev sat til P<0,05 (to-halet).