Hodnocení vnímavosti homogenního endometria v pozdní folikulární fázi

Subjekty Dvacet osm zdánlivě zdravých žen, z toho čtrnáct s ultrasonografickým homogenním echem (skupina 1) a dalších čtrnáct s "trojřadým" (skupina 2) endometriem v pozdní folikulární fázi, bylo na našem oddělení zapojeno do studie mezi zářím 2010 a listopad 2011. Zahrnutá kritéria pro obě skupiny žen byla ≤ 40 let, s pravidelným menstruačním cyklem (25-35 dní), bez použití nitroděložního tělíska nebo perorální antikoncepce alespoň 3 měsíce před studií. Kritéria vyloučení byly ženy se syndromem polycystických ovarií (PCOS), endometriózou, předčasným selháním vaječníků (POF) a potratem do 1 roku nebo anamnézou zánětlivého onemocnění pánve. Průměrný věk žen byl 31,9±3,7 let (rozmezí 26-39 let). Průměrný index tělesné hmotnosti byl 20,96±2,46 kg/m2 (rozsah, 17,58-26,04 kg/m2). S pravidelným menstruačním cyklem (25-35 dní) a 2-11letou neplodností všechny subjekty podepsaly řádný souhlas. Studie byla schválena naší institucionální etickou komisí.

Monitorování ovulace Ženy byly sledovány po dobu jednoho cyklu odběrem vzorků krve a moči. Ovulace byla monitorována vaginální ultrasonografií (aloka-1000, UST-985, 5 MHz transvaginální sonda, aloka Co. Ltd, Tokyo, Japonsko). Byla měřena tloušťka dvou vrstev endometria. Endometriální obrazec byl hodnocen podle klasifikace navržené Gonenem a Casperem následovně: endometrium, které bylo zcela homogenně hyperechogenní bez centrální echogenní linie, bylo považováno za homogenní echogenní obrazec a trojliniový obrazec sestával z centrální hyperechogenní linie obklopené dvěma hypoechogenní vrstvy. Růst folikulů, ovulace a vývoj žlutého tělíska byly sledovány pomocí dvourovinných skenů. Účastníci identifikovali den nárůstu LH testováním ranní moči (Davidův ovulační test, Rubio Biotech Co. Ltd., Shantou, Čína). Den nárůstu LH byl stanoven ve vzorcích moči, kdy nárůst LH dosáhl nejvyšší hodnoty, kdy byly odebrány i vzorky krve. Den cyklu označuje první den menstruačního krvácení. U žen, které mají normální ovulační cykly s intervaly 25-35 dnů, se očekává ovulace nejdříve 11. den a nejpozději 21. den. Vzorky periferní krve byly získány punkcí žíly v den nárůstu LH a 6-7 dnů po ovulaci. Krev byla oddělena centrifugací během 1 hodiny a sérum bylo skladováno při -20 °C, dokud nebyly testovány koncentrace LH, FSH, estradiolu (E2) a progesteronu.

Endometriální biopsie U každého subjektu byly provedeny dvě endometriální biopsie během jednoho menstruačního cyklu. Časná biopsie byla provedena v preovulační den (pozdní folikulární fáze) a endometriální tkáně byly odebrány z přední stěny děložní dutiny. Zatímco pozdní biopsie byla provedena v den ovulace +7 (střední fáze nebo implantační vdovská fáze) a vzorek endometria byl odebrán ze zadní stěny děložní dutiny s dilatací děložního hrdla nebo bez něj pomocí endometriální kyrety (#4164 prebet , Genetika, pommel, Belgie). Každý vzorek byl rozdělen na tři kusy a ihned fixován. Vzorky pro rastrovací elektronovou mikroskopii pro fixaci v roztoku obsahujícím 2,5 % (hm./obj.) glutaraldehydu, 0,5 % paraformaldehydu, 0,1 mol/l sacharózy, 0,1 mol/l kakodylátu sodného a 3 mmol/l chloridu vápenatého (pH, 7,4) . Vzorky pro imunohistochemii byly fixovány ve 4% formalínu. Vzorky pro transmisní elektronovou mikroskopii byly fixovány 2,5% glutaraldehydarzeničnanem;

Rastrovací elektronová mikroskopie Vzorky byly dvakrát promyty v pufru obsahujícím 0,15 mol/l kakodylátu sodného a 3 mmol/l chloridu vápenatého (PH, 7,4) a jednou v destilované vodě. Vzorky byly dehydratovány nejprve ve zvyšujících se koncentracích ethanolu (70 %, 95 % a 99,5 %) a poté v acetonu; byly vysušeny v sušárně s kritickým bodem za použití oxidu uhličitého. Vzorky byly upevněny, potaženy platinou a zkoumány pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu (S-3000N, Hitachi, Tokio, Japonsko). Byly klasifikovány vývojové fáze pinopoda. Protože se pinopodi na povrchu endometria nevyvíjejí přesně ve stejnou dobu, nebyli pinopodi rovnoměrně rozmístěni po povrchu endometria, proto jsme v naší studii zkoumali pět polí každého vzorku biopsie a analyzovali vývoj a distribuci pinopodů. Morfologické hodnocení bylo definováno jako: žádní pinopodi, vyvíjející se pinopodi, plně vyvinutí pinopodi a regresující pinopodi. Semikvantitativní hodnocení bylo definováno následovně: - (0 %), + (﹤20 %), ++ (20-50 %) a +++ (>50 %).

Imunohistochemie Pro imunohistochemickou analýzu bylo použito 56 bioptických vzorků od 28 pacientů. Pro studie LIF, integrinu av, VEGF a MMP-9 byly 4 um řezy zalité v parafinu deparafinizovány 20 minut v acetonu při 70 °C. Endogenní peroxidáza byla blokována 3% H2O2 po dobu 10 minut. Získávání antigenu se vařilo zahříváním po dobu 5 minut v 0,01 M citrátovém pufru při pH 6,0 a poté byly řezy inkubovány přes noc při 4 °C se specifickými protilátkami, které byly zředěny v poměru 1:50. Protilátky použité v této studii byly polyklonální protilátky (PAB) LIF, integrin av, VEGF a MMP-9 (BA 1239, BA0957, BA0407 a BA0573, Booster Co Ltd, Wuhan, Čína). Řezy byly opláchnuty ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS), blokovány 10% normálním kozím sérem po dobu 30 minut a poté inkubovány s kozími anti-králičími biotinylovanými imunoglobuliny (IgG) (SV0002, Booster Co Ltd, Wuhan, Čína) při 37 °C po dobu 30 min. Pro studii integrinu β3 byly řezy inkubovány s 3% peroxidem vodíku po dobu 10 minut po opravě antigenu za horka varem při 95 °C 0,01M citrátového pufru (pH 6,0), poté inkubovány s polyklonálními protilátkami integrin β3 (sc-6626, santa, USA) zředěný v poměru 1:100 přes noc při 4 °C. Polymer Helper (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Peking, Čína) byl přidán při teplotě místnosti a s intervalem 20 minut, Polyperoxidáza-anti-kozí IgG (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Peking, Čína) byla přidána. Sklíčka byla poté promyta v PBS a obarvena 3,3-diaminobenzidinem v H202 (DAB, vitrogen, Kalifornie, USA). Sekce byly nakonec umyty ve vodě. V každém případě byla provedena negativní kontrola vynecháním inkubace s primární specifickou protilátkou. Byla hodnocena reaktivita každé polyklonální protilátky s endometriálními žlázami a povrchovým epitelem, stromálními buňkami. Barvení bylo hodnoceno semikvantitativně pomocí systému klasifikace. Intenzita barvení a počet obarvených buněk byly odstupňovány na stupnici 0 = žádné barvení, +/- = málo obarvených buněk, + = slabé barvení, ++ = mírné barvení a +++ = silné barvení. K výpočtu byl použit vzorec H-skóre=ΣPi(i+1). Jeden pozorovatel, který byl oslepen, aby identifikoval preparáty, provedl všechna hodnocení. Po dokončení studie stejný pozorovatel znovu prozkoumal sklíčka, aby se zajistila reprodukovatelnost semikvantitativního hodnocení.

Transmisní elektronová mikroskopie Vzorky pro transmisní elektronovou mikroskopii byly fixovány v 2,5% glutaraldehydu v PBS (pH 7,4) a následně fixovány v 1% oxidu osmičelém. Po dehydrataci v sérii odstupňovaného ethanolu byly vzorky umístěny do propylenoxidu a vloženy do Eponu, obarveny acetátem uranyl a citrátem olovnatým a zkoumány v transmisním elektronovém mikroskopu.

Statistická analýza Pro statistické analýzy byl použit Statistics Package for Social Science (SPSS 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL). Průměr ± S.D byl vyhodnocen pomocí analýzy studentova t-testu, seřazená data byla analyzována Rank Sum Testem (Mann-Whitney test) a kvalitativní data byla analyzována chí-kvadrát testem. Statistická významnost byla nastavena na P<0,05 (dvoustranná).