Avaliação da receptividade do endométrio homogêneo na fase folicular tardia

Sujeitos Vinte e oito mulheres aparentemente saudáveis, quatorze delas com eco ultrassonográfico homogêneo (grupo 1) e outras quatorze com endométrio "linha tripla" (grupo 2) na fase folicular tardia, estiveram envolvidas em nosso Departamento para o estudo entre setembro 2010 e novembro de 2011. Os critérios incluídos para ambos os grupos de mulheres foram ≤40 anos de idade, com ciclos menstruais regulares (25-35 dias), sem uso de dispositivo intrauterino ou contraceptivo oral pelo menos 3 meses antes do estudo. Os critérios de exclusão foram mulheres com síndrome do ovário policístico (SOP), endometriose, falência ovariana prematura (FOP) e aborto dentro de 1 ano ou história de doença inflamatória pélvica. A média de idade das mulheres foi de 31,9±3,7 anos (variando de 26 a 39 anos). O índice de massa corporal médio foi de 20,96±2,46 kg/m2 (intervalo, 17,58-26,04 kg/m2). Com um ciclo menstrual regular (25-35 dias) e história infértil de 2-11 anos, todos os indivíduos assinaram os formulários de consentimento apropriados. O estudo foi aprovado pelo nosso Comitê de Ética Institucional.

Monitoramento da ovulação As mulheres foram acompanhadas por um ciclo, obtendo-se amostras de sangue e urina. A ovulação foi monitorada com ultrassonografia vaginal (aloka-1000, UST-985, sonda transvaginal de 5 MHz, aloka Co. Ltd, Tóquio, Japão). A espessura de duas camadas endometriais foi medida. O padrão endometrial foi avaliado de acordo com a classificação proposta por Gonen e Casper da seguinte forma: um endométrio que era totalmente homogêneo hiperecóico sem uma linha ecogênica central foi considerado um padrão ecogênico homogêneo e padrão de linha tripla consistiu de uma linha hiperecóica central circundada por duas camadas hipoecóicas. O crescimento dos folículos, a ovulação e o desenvolvimento do corpo lúteo foram monitorados por varreduras de dois planos. Os participantes identificaram o dia do pico de LH testando a urina matinal (teste de ovulação de David, Rubio Biotech Co. Ltd., Shantou, China). O dia do pico de LH foi determinado em amostras de urina quando o pico de LH atingiu seu valor mais alto no qual as amostras de sangue também foram coletadas. O dia do ciclo refere-se ao primeiro dia de sangramento menstrual. Espera-se que mulheres com ciclos ovulatórios normais com intervalos de 25 a 35 dias ovulem no dia 11, no mínimo, e no dia 21, no máximo. As amostras de sangue periférico foram obtidas por punção venosa no dia do pico de LH e 6-7 dias após a ovulação. O sangue foi separado por centrifugação em 1 hora e o soro foi armazenado a -20 ℃ até que as concentrações de LH, FSH, estradiol (E2) e progesterona fossem testadas.

Biópsia endometrial Duas biópsias endometriais foram realizadas durante um único ciclo menstrual em cada indivíduo. A biópsia precoce foi realizada no dia pré-ovulatório (fase folicular tardia) e os tecidos endometriais foram coletados da parede anterior da cavidade uterina. Considerando que a biópsia tardia foi realizada no dia +7 da ovulação (fase lútea média ou fase de implantação viúva), e a amostra endometrial foi coletada da parede posterior da cavidade uterina com ou sem dilatação do colo do útero usando uma cureta endometrial (#4164 prebet , Genética, pomo, Bélgica). Cada amostra foi dividida em três peças e imediatamente fixadas. Amostras para microscopia eletrônica de varredura fixadas em solução contendo 2,5% (peso/vol) de glutaraldeído, 0,5% de paraformaldeído, 0,1 mol/L de sacarose, 0,1 mol/L de cacodilato de sódio e 3 mmol/L de cloreto de cálcio (pH, 7,4) . As amostras para imuno-histoquímica foram fixadas em formol a 4%. As amostras para microscopia eletrônica de transmissão foram fixadas em arseniato de glutaraldeído 2,5%;

Microscopia eletrônica de varredura As amostras foram lavadas duas vezes em tampão contendo 0,15 mol/L de cacodilato de sódio e 3 mmol/L de cloreto de cálcio (PH, 7,4) e uma vez em água destilada. Os espécimes foram desidratados primeiro em concentrações crescentes de etanol (70%, 95% e 99,5%) e depois em acetona; eles foram secos em um secador de ponto crítico usando dióxido de carbono. Os espécimes foram montados, revestidos com platina e examinados usando um microscópio eletrônico de varredura (S-3000N, Hitachi, Tóquio, Japão). A fase de desenvolvimento do pinopode foi classificada. Como os pinopódios na superfície endometrial não se desenvolvem exatamente ao mesmo tempo, os pinopódios não foram distribuídos uniformemente sobre a superfície endometrial, portanto, em nosso estudo, examinamos cinco campos de cada amostra de biópsia e analisamos o desenvolvimento e a distribuição dos pinopódios. A avaliação da morfologia foi definida como: sem pinopodos, em desenvolvimento, em desenvolvimento, em completo desenvolvimento e em regressão. A avaliação semiquantitativa foi definida da seguinte forma:- (0%), + (﹤20%), ++ (20-50%) e +++(>50%).

Imuno-histoquímica 56 amostras de biópsia de 28 pacientes foram utilizadas para análise imuno-histoquímica. Para estudos de LIF, integrina αv, VEGF e MMP-9, seções de 4 um embebidas em parafina foram desparafinizadas 20 min em acetona a 70 ℃. A peroxidase endógena foi bloqueada com H2O2 3% por 10 min. A recuperação antigênica foi fervida por aquecimento por 5 min em tampão citrato 0,01 M a pH 6,0 e, em seguida, as seções foram incubadas durante a noite a 4 ℃ com os anticorpos específicos que foram diluídos a 1:50. Os anticorpos utilizados neste estudo foram os anticorpos policlonais (PAB) LIF, integrina αv, VEGF e MMP-9 (BA 1239, BA0957,BA0407 e BA0573, Booster Co Ltd, Wuhan, China). As seções foram lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS), bloqueadas com 10% de soro normal de cabra por 30 min e depois incubadas com imunoglobulinas biotiniladas anti-coelho de cabra (IgG) (SV0002, Booster Co Ltd, Wuhan, China) a 37 ℃ por 30 min. Para o estudo da integrina β3, as seções foram incubadas com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 min após o reparo a quente do antígeno fervendo a 95 ℃ de tampão citrato 0,01 M (pH 6,0), depois incubadas com anticorpos policlonais integrina β3 (sc-6626, santa, EUA) diluído a 1:100 durante a noite a 4℃. Polymer Helper (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, China) foi adicionado à temperatura ambiente e com um intervalo de 20 min, Poly Peroxidase-anti-cabra IgG (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Beijing, China) foi adicionado. As lâminas foram então lavadas em PBS e coradas com 3,3-diaminobenzidina em H2O2 (DAB, vitrogen, Califórnia, EUA). Os cortes foram finalmente lavados em água. Em todos os casos, um controle negativo foi realizado por omissão de incubação com o anticorpo primário específico. A reatividade de cada anticorpo policlonal com glândulas endometriais e epitélio de superfície, células estromais foi avaliada. A coloração foi avaliada semiquantitativamente usando um sistema de classificação. A intensidade da coloração e o número de células coradas foram classificados em uma escala de 0 = sem coloração, +/- = poucas células coradas, + = coloração fraca, ++ = coloração moderada e +++ = coloração forte. A fórmula de H-score=ΣPi(i+1) foi utilizada para o cálculo. Um observador que desconhecia a identificação das lâminas realizou todas as avaliações. Após a conclusão do estudo, o mesmo observador reexaminou as lâminas para garantir a reprodutibilidade da avaliação semiquantitativa.

Microscopia eletrônica de transmissão As amostras para microscopia eletrônica de transmissão foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% em PBS (pH 7,4) e pós-fixadas em tetróxido de ósmio a 1%. Após desidratação em série graduada de etanol, os espécimes foram colocados em óxido de propileno e incluídos em Epon, corados com acetato de uranila e citrato de chumbo e examinados em microscópio eletrônico de transmissão.

Análise Estatística O Pacote Estatístico para Ciências Sociais (SPSS 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL) foi usado para análises estatísticas. A média±DP foi avaliada por meio da análise do teste t de Student, os dados classificados foram analisados ​​com o teste Rank Sum (teste de Mann-Whitney) e os dados qualitativos foram analisados ​​com o teste qui-quadrado. A significância estatística foi estabelecida em P<0,05 (duas caudas).