Beurteilung der Empfänglichkeit des homogenen Endometriums in der späten Follikelphase

Probanden Achtundzwanzig scheinbar gesunde Frauen, davon vierzehn mit einem sonographisch homogenen Echo (Gruppe 1) und weitere vierzehn mit einem "triple-line" (Gruppe 2) Endometrium in der späten Follikelphase, wurden zwischen September in unsere Abteilung für die Studie einbezogen 2010 und November 2011. Die eingeschlossenen Kriterien für beide Frauengruppen waren ein Alter von ≤ 40 Jahren mit regelmäßigen Menstruationszyklen (25-35 Tage) ohne Verwendung eines Intrauterinpessars oder eines oralen Kontrazeptivums mindestens 3 Monate vor der Studie. Ausschlusskriterien waren Frauen mit polyzystischem Ovarialsyndrom (PCOS), Endometriose, vorzeitiger Ovarialinsuffizienz (POF) und einem Schwangerschaftsabbruch innerhalb von 1 Jahr oder einer Vorgeschichte von entzündlichen Erkrankungen des Beckens. Das Durchschnittsalter der Frauen betrug 31,9 ± 3,7 Jahre (Bereich 26–39 Jahre). Der mittlere Body-Mass-Index betrug 20,96 ± 2,46 kg/m2 (Bereich, 17.58-26.04 kg/m2). Mit einem regelmäßigen Menstruationszyklus (25–35 Tage) und einer unfruchtbaren Vorgeschichte von 2–11 Jahren hatten alle Probanden die entsprechenden Einverständniserklärungen unterzeichnet. Die Studie wurde von unserem Institutional Ethics Committee genehmigt.

Überwachung des Eisprungs Die Frauen wurden einen Zyklus lang verfolgt, indem Blutproben und Urinproben entnommen wurden. Die Ovulation wurde mit vaginalem Ultraschall überwacht (aloka-1000, UST-985, 5 MHz transvaginale Sonde, aloka Co. Ltd, Tokio, Japan). Die Dicke von zwei Endometriumschichten wurde gemessen. Das Endometriummuster wurde gemäß der von Gonen und Casper vorgeschlagenen Klassifikation wie folgt bewertet: Ein vollständig homogen echoreiches Endometrium ohne eine zentrale echogene Linie wurde als homogenes Echomuster angesehen, und ein Dreifachlinienmuster bestand aus einer zentralen echoreichen Linie, die von zwei umgeben war echoarme Schichten. Das Follikelwachstum, die Ovulation und die Entwicklung des Corpus luteum wurden mithilfe von Zwei-Ebenen-Scans überwacht. Die Teilnehmer identifizierten den Tag des LH-Anstiegs, indem sie den Morgenurin testeten (David-Ovulationstest, Rubio Biotech Co. Ltd., Shantou, China). Der Tag des LH-Anstiegs wurde in Urinproben bestimmt, an dem der LH-Anstieg seinen höchsten Wert erreichte, an dem auch die Blutproben entnommen wurden. Der Zyklustag bezeichnet den ersten Tag der Menstruationsblutung. Bei Frauen mit normalen Ovulationszyklen mit Intervallen von 25-35 Tagen wird frühestens am 11. Tag und spätestens am 21. Tag mit dem Eisprung gerechnet. Die peripheren Blutproben wurden durch Venenpunktion am Tag des LH-Anstiegs und 6–7 Tage nach der Ovulation erhalten. Das Blut wurde innerhalb von 1 Stunde durch Zentrifugation abgetrennt, und das Serum wurde bei -20 °C gelagert, bis die Konzentrationen von LH, FSH, Östradiol (E2) und Progesteron bestimmt wurden.

Endometriumbiopsie Zwei Endometriumbiopsien wurden während eines einzigen Menstruationszyklus bei jeder Person durchgeführt. Die frühe Biopsie wurde am präovulatorischen Tag (späte Follikelphase) durchgeführt und das Endometriumgewebe wurde von der Vorderwand der Gebärmutterhöhle entnommen. Während die späte Biopsie am Ovulationstag +7 (Midlutealphase oder Implantationsphase) durchgeführt wurde und die Endometriumprobe von der hinteren Wand der Gebärmutterhöhle mit oder ohne Dilatation des Gebärmutterhalses unter Verwendung einer Endometriumkürette (#4164 prebet , Genetik, Knauf, Belgien). Jede Probe wurde in drei Stücke geteilt und sofort fixiert. Proben für die Rasterelektronenmikroskopie zur Fixierung in einer Lösung mit 2,5 % (wt/vol) Glutaraldehyd, 0,5 % Paraformaldehyd, 0,1 mol/l Saccharose, 0,1 mol/l Natriumcacodylat und 3 mmol/l Calciumchlorid (pH 7,4) . Proben für die Immunhistochemie wurden in 4 % Formalin fixiert. Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie wurden mit 2,5 % Glutaraldehydarsenat fixiert;

Rasterelektronenmikroskopie Proben wurden zweimal in einem Puffer gewaschen, der 0,15 mol/l Natriumcacodylat und 3 mmol/l Calciumchlorid (pH 7,4) enthielt, und einmal in destilliertem Wasser. Die Proben wurden zuerst in steigenden Ethanolkonzentrationen (70 %, 95 % und 99,5 %) und dann in Aceton dehydriert; sie wurden in einem kritischen Punkttrockner unter Verwendung von Kohlendioxid getrocknet. Die Proben wurden montiert, mit Platin beschichtet und unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (S-3000N, Hitachi, Tokio, Japan) untersucht. Die Entwicklungsphase des Pinopoden wurde klassifiziert. Da sich die Pinopoden auf der Endometriumoberfläche nicht genau zur gleichen Zeit entwickeln, waren die Pinopoden nicht gleichmäßig über die Endometriumoberfläche verteilt, daher haben wir in unserer Studie fünf Felder jeder Biopsieprobe untersucht und die Entwicklung und Verteilung der Pinopoden analysiert. Die Morphologiebewertung wurde wie folgt definiert: keine Pinopoden, sich entwickelnde Pinopoden, voll entwickelte Pinopoden und sich zurückbildende Pinopoden. Die halbquantitative Bewertung wurde wie folgt definiert: - (0%), + (﹤20%), ++ (20-50%) und +++(>50%).

Immunhistochemie 56 Biopsieproben von 28 Patienten wurden für die immunhistochemische Analyse verwendet. Für LIF-, Integrin-αv-, VEGF- und MMP-9-Studien wurden in Paraffin eingebettete 4-um-Schnitte 20 min in Aceton bei 70 °C entparaffiniert. Endogene Peroxidase wurde mit 3% H2O2 für 10 min blockiert. Die Antigengewinnung erfolgte durch 5-minütiges Erhitzen in 0,01 M Citratpuffer bei pH 6,0 zum Kochen, und dann wurden die Schnitte über Nacht bei 4 °C mit den spezifischen Antikörpern, die 1:50 verdünnt waren, inkubiert. Die in dieser Studie verwendeten Antikörper waren polyklonale Antikörper (PAB) LIF, Integrin αv, VEGF und MMP-9 (BA 1239, BA0957, BA0407 und BA0573, Booster Co Ltd, Wuhan, China). Die Schnitte wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, mit 10 % normalem Ziegenserum für 30 min blockiert und dann mit biotinylierten Ziegen-anti-Kaninchen-Immunglobulinen (IgG) (SV0002, Booster Co Ltd, Wuhan, China) bei 37 °C inkubiert für 30 min. Für die Integrin-β3-Studie wurden die Schnitte nach der Heißreparatur des Antigens durch Kochen bei 95 °C in 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) 10 Minuten lang mit 3 % Wasserstoffperoxid inkubiert und dann mit polyklonalen Antikörpern Integrin β3 (sc-6626, Santa, USA) verdünnt auf 1:100 über Nacht bei 4℃. Polymer Helper (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Peking, China) wurde bei Raumtemperatur und mit einem Intervall von 20 min zugegeben, Polyperoxidase-Anti-Ziege-IgG (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Peking, China) wurde hinzugefügt. Die Objektträger wurden dann in PBS gewaschen und mit 3,3-Diaminobenzidin in H 2 O 2 (DAB, Vitrogen, Kalifornien, USA) gefärbt. Die Schnitte wurden schließlich in Wasser gewaschen. In jedem Fall wurde eine Negativkontrolle durchgeführt, indem die Inkubation mit dem primären spezifischen Antikörper weggelassen wurde. Die Reaktivität jedes polyklonalen Antikörpers mit Endometriumdrüsen und Oberflächenepithel, Stromazellen wurde bewertet. Die Färbung wurde halbquantitativ unter Verwendung eines Bewertungssystems bewertet. Die Färbungsintensität und die Anzahl der gefärbten Zellen wurden auf einer Skala von 0 = keine Färbung, +/- = wenige gefärbte Zellen, + = schwache Färbung, ++ = mäßige Färbung und +++ = starke Färbung bewertet. Zur Berechnung wurde die Formel H-score=ΣPi(i+1) verwendet. Ein Beobachter, der für die Identifizierung der Objektträger blind war, führte alle Bewertungen durch. Nach Abschluss der Studie untersuchte derselbe Beobachter die Objektträger erneut, um die Reproduzierbarkeit der semiquantitativen Bewertung sicherzustellen.

Transmissionselektronenmikroskopie Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie wurden in 2,5 % Glutaraldehyd in PBS (pH 7,4) fixiert und in 1 % Osmiumtetroxid nachfixiert. Nach der Dehydratisierung in einer abgestuften Ethanolreihe wurden die Proben in Propylenoxid gelegt und in Epon eingebettet, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und im Transmissionselektronenmikroskop untersucht.

Statistische Analyse Für statistische Analysen wurde das Statistics Package for Social Science (SPSS 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL) verwendet. Der Mittelwert ± Standardabweichung wurde unter Verwendung der Analyse des Schüler-t-Tests bewertet, die Rangdaten wurden mit dem Rangsummentest (Mann-Whitney-Test) analysiert und die qualitativen Daten wurden mit dem Chi-Quadrat-Test analysiert. Die statistische Signifikanz wurde auf P < 0,05 (zweiseitig) festgelegt.