Ocena receptywności jednorodnego endometrium w późnej fazie pęcherzyka

Pacjenci Dwadzieścia osiem pozornie zdrowych kobiet, czternaście z nich z ultrasonograficznym jednorodnym echokardiograficznym (grupa 1) i czternaście z „potrójną linią” (grupa 2) endometrium w późnej fazie folikularnej zostało włączonych do naszego Oddziału do badań w okresie od września 2010 i listopad 2011. Kryteriami włączonymi dla obu grup były kobiety w wieku ≤40 lat, z regularnymi cyklami miesiączkowymi (25-35 dni), bez stosowania wkładki wewnątrzmacicznej lub doustnej antykoncepcji co najmniej 3 miesiące przed badaniem. Kryteriami wykluczenia były kobiety z zespołem policystycznych jajników (PCOS), endometriozą, przedwczesną niewydolnością jajników (POF) i aborcją w ciągu 1 roku lub chorobą zapalną miednicy mniejszej w wywiadzie. Średni wiek kobiet wynosił 31,9±3,7 lat (przedział 26-39 lat). Średni wskaźnik masy ciała wynosił 20,96±2,46 kg/m2 (zakres 17,58-26,04 kg/m2). Przy regularnym cyklu miesiączkowym (25-35 dni) i niepłodności od 2 do 11 lat wszystkie badane miały podpisane odpowiednie formularze zgody. Badanie zostało zatwierdzone przez naszą instytucjonalną komisję etyczną.

Monitorowanie owulacji Kobiety obserwowano przez jeden cykl, pobierając próbki krwi i próbki moczu. Owulację monitorowano za pomocą ultrasonografii pochwy (aloka-1000, UST-985, sonda przezpochwowa 5 MHz, aloka Co. Ltd, Tokio, Japonia). Zmierzono grubość dwóch warstw endometrium. Obraz endometrium oceniano zgodnie z klasyfikacją zaproponowaną przez Gonena i Caspera w następujący sposób: endometrium całkowicie jednorodnie hiperechogeniczne bez środkowej linii echogenicznej uznano za jednorodny wzór echa, a wzór potrójnej linii składał się z centralnej linii hiperechogenicznej otoczonej dwoma warstwy hipoechogeniczne. Wzrost pęcherzyków, owulację i rozwój ciałka żółtego monitorowano za pomocą skanów dwupłaszczyznowych. Uczestnicy identyfikowali dzień wyrzutu LH, badając poranny mocz (test owulacyjny Davida, Rubio Biotech Co. Ltd., Shantou, Chiny). W próbkach moczu określono dzień wyrzutu LH, w którym wyrzut LH osiągnął najwyższą wartość, w którym również pobrano próbki krwi. Dzień cyklu odnosił się do pierwszego dnia krwawienia miesiączkowego. Kobiety, które mają normalne cykle owulacyjne w odstępach 25-35 dni, powinny spodziewać się owulacji najwcześniej 11 dnia, a najpóźniej 21 dnia. Próbki krwi obwodowej pobierano przez nakłucie żyły w dniu wyrzutu LH i 6-7 dni po owulacji. Krew oddzielono przez odwirowanie w ciągu 1 godziny, a surowicę przechowywano w temperaturze -20°C do czasu oznaczenia stężenia LH, FSH, estradiolu (E2) i progesteronu.

Biopsja endometrium U każdej pacjentki wykonano dwie biopsje endometrium podczas jednego cyklu miesiączkowego. Biopsję wczesną wykonano w dniu przedowulacyjnym (późna faza folikularna) i pobrano tkanki endometrium z przedniej ściany jamy macicy. Podczas gdy biopsję późną wykonano w dniu owulacji +7 (faza środkowa lutealna lub faza wdowa po implantacji), a próbkę endometrium pobrano z tylnej ściany jamy macicy z rozwarciem lub bez rozwarcia szyjki macicy za pomocą łyżeczki do endometrium (#4164 prebet , Genetyka, głowica, Belgia). Każdą próbkę podzielono na trzy części i natychmiast utrwalono. Próbki do skaningowego mikroskopu elektronowego do utrwalenia w roztworze zawierającym 2,5% (wag./obj.) aldehydu glutarowego, 0,5% paraformaldehydu, 0,1 mol/l sacharozy, 0,1 mol/l kakodylanu sodu i 3 mmol/l chlorku wapnia (pH 7,4) . Próbki do immunohistochemii utrwalano w 4% formalinie. Próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej utrwalono 2,5% arsenianem aldehydu glutarowego;

Skaningowa mikroskopia elektronowa Próbki przemyto dwukrotnie w buforze zawierającym 0,15 mol/l kakodylanu sodu i 3 mmol/l chlorku wapnia (PH, 7,4) i raz w wodzie destylowanej. Próbki odwadniano najpierw we wzrastających stężeniach etanolu (70%, 95% i 99,5%), a następnie w acetonie; wysuszono je w suszarce w punkcie krytycznym przy użyciu dwutlenku węgla. Próbki zamontowano, pokryto platyną i zbadano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (S-3000N, Hitachi, Tokio, Japonia). Sklasyfikowano fazy rozwojowe pinopodów. Ponieważ pinopody na powierzchni endometrium nie rozwijają się dokładnie w tym samym czasie, pinopody nie były równomiernie rozmieszczone na powierzchni endometrium, dlatego w naszym badaniu zbadaliśmy pięć pól każdej próbki biopsji i przeanalizowaliśmy rozwój i rozmieszczenie pinopodów. Ocenę morfologiczną zdefiniowano jako: brak pinopodów, pinopody rozwijające się, pinopody w pełni rozwinięte i pinopody regresujące. Ocena półilościowa została zdefiniowana następująco: - (0%), + (﹤20%), ++ (20-50%) i +++(>50%).

Immunohistochemia Do analizy immunohistochemicznej wykorzystano 56 biopsji pobranych od 28 pacjentów. Do badań LIF, integryny αv, VEGF i MMP-9 skrawki zatopione w parafinie o grubości 4 μm odparafinowano przez 20 minut w acetonie w temperaturze 70°C. Endogenną peroksydazę blokowano 3% H2O2 przez 10 min. Odzyskiwanie antygenu prowadzono przez ogrzewanie przez 5 minut w 0,01 M buforze cytrynianowym przy pH 6,0, a następnie skrawki inkubowano przez noc w temperaturze 4°C ze specyficznymi przeciwciałami, które rozcieńczono w stosunku 1:50. Przeciwciałami stosowanymi w tym badaniu były przeciwciała poliklonalne (PAB) LIF, integryna αv, VEGF i MMP-9 (BA 1239, BA0957, BA0407 i BA0573, Booster Co Ltd, Wuhan, Chiny). Skrawki przepłukano solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zablokowano 10% normalną kozią surowicą przez 30 minut, a następnie inkubowano z kozimi przeciwkróliczymi biotynylowanymi immunoglobulinami (IgG) (SV0002, Booster Co Ltd, Wuhan, Chiny) w 37 ℃ przez 30 min. Do badania integryny β3 skrawki inkubowano z 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut po naprawie antygenu na gorąco przez gotowanie w temperaturze 95 ℃ 0,01 M buforu cytrynianowego (pH 6,0), a następnie inkubowano z poliklonalnymi przeciwciałami integryny β3 (sc-6626, Santa, USA) rozcieńczony w stosunku 1:100 przez noc w temperaturze 4℃. Polymer Helper (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Pekin, Chiny) dodano w temperaturze pokojowej iw odstępie 20 minut, poliperoksydaza-anty-koza IgG (PV-9003, Zhong-Shang Co Ltd, Pekin, Chiny) został dodany. Szkiełka następnie przemyto w PBS i zabarwiono 3,3-diaminobenzydyną w H2O2 (DAB, vitrogen, Kalifornia, USA). Skrawki na koniec przemyto wodą. W każdym przypadku przeprowadzono kontrolę negatywną przez pominięcie inkubacji z pierwotnym swoistym przeciwciałem. Oceniono reaktywność każdego przeciwciała poliklonalnego z gruczołami endometrium i nabłonkiem powierzchniowym, komórkami zrębowymi. Barwienie oceniano półilościowo, stosując system stopniowania. Intensywność barwienia i liczbę wybarwionych komórek oceniono w skali 0 = brak barwienia, +/- = kilka wybarwionych komórek, + = słabe wybarwienie, ++ = umiarkowane wybarwienie i +++ = silne wybarwienie. Do obliczeń wykorzystano wzór H-score=ΣPi(i+1). Jeden obserwator, który nie mógł zidentyfikować slajdów, przeprowadził wszystkie oceny. Po zakończeniu badania ten sam obserwator ponownie zbadał preparaty, aby zapewnić powtarzalność oceny półilościowej.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa Próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej utrwalano w 2,5% aldehydzie glutarowym w PBS (pH 7,4) i utrwalano w 1% tetratlenku osmu. Po odwodnieniu w stopniowanej serii etanolu próbki umieszczono w tlenku propylenu i zatopiono w Epon, wybarwiono octanem uranylu i cytrynianem ołowiu i zbadano w transmisyjnym mikroskopie elektronowym.

Analiza statystyczna Do analiz statystycznych wykorzystano Statistics Package for Social Science (SPSS 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL). Średnią ± SD oceniono za pomocą analizy testu t-Studenta, dane rankingowe przeanalizowano za pomocą testu sumy rang (test Manna-Whitneya), a dane jakościowe za pomocą testu chi-kwadrat. Istotność statystyczną ustalono na P<0,05 (dwustronny).