중피종 환자의 생물학적 특성에 대한 관찰적 전향적 분석

이것은 악성 흉막 중피종(MPM) 환자의 생물학적 특성에 대한 관찰 전향적 분석입니다. 냉동 및 파라핀 포매 종양 표본과 환자의 흉막삼출액을 수집하여 다음 분석을 통해 분석합니다.

1. 흉막 삼출액에서 TAM 및 종양 세포의 정제. 세포 성분과 비세포 성분을 분리하기 위해 흉막 삼출액을 원심분리합니다. 무세포 상청액을 수집하고 분비 단백질의 식별 및 특성화를 위한 추가 분석(ELISA, 웨스턴 블롯)에 적용할 것입니다. 흉막삼출액 세포 성분은 백혈구 조성을 평가하기 위해 세포형광측정법으로 특성화됩니다(예: 대식세포, 호중구, 림프구). 다음으로 세포 구성 요소에서 TAM을 분리하기 위해 조사관은 난소 암종 환자에서 파생된 복수에서 TAM을 정제하기 위해 조사자 그룹에서 현재 수행되는 표준 프로토콜을 채택합니다. 간단히 말해서, TAM은 무혈청 조건에서 배양 플레이트에 부착하는 선택적인 능력에 의해 분리될 것입니다. 배양 1시간 후, 부착되지 않은 세포(주로 종양 세포 및 기타 염증 세포)는 배지 제트로 철저히 세척됩니다. 부착 후, 세포를 표준 배양 조건에서 1시간 동안 휴지시킨 후 단백질을 추출하기 위해 용해시켰다. 백혈구에서 종양 세포를 분리하기 위해 세포 분류 기반 접근법이 사용됩니다. 간단히 말해서, 염증 세포는 림프구 공통 항원(CD45) 항체로 염색되고 음성 세포(종양 세포)는 세포 분류에 의해 분리됩니다. 다음 종양 세포는 표준 배양 조건에서 성장하고 증폭됩니다.
2. TAM 및 종양 세포의 질량 분석 분석 TAM 및 종양 세포의 프로테옴 생성 및 인-프로테옴 지도는 전체 프로테옴 및 인-프로테옴 모두의 정량화에 의해 달성됩니다. TAM으로 얻은 결과는 미처리 M1 및 M2 극성화 단핵구 유래 대식세포(M-DM)와 비교할 것이며, 환자의 흉막 삼출액에서 정제된 종양 세포는 인간 중피 세포와 관련하여 분석할 것입니다. 정제된 TAM과 환자의 흉막 삼출액에서 추출한 종양 세포에서 얻은 단백질 샘플은 용해/아세톤 침전을 사용하여 추출합니다. 세포 추출물은 이후에 트립신 소화를 거치게 되며 생성된 펩타이드는 "iTRAQ" 시약으로 라벨링됩니다. 표지된 펩티드는 강한 양이온 교환(SCX) 크로마토그래피인 분리의 첫 번째 차원으로 분리됩니다. 필요한 경우 분획을 수집하고 인광을 강화합니다. 풀링된 펩타이드 혼합물은 탈염/농축 사전 컬럼 및 분리를 위한 분석 컬럼의 2단계 프로세스로 구성된 2차원 크로마토그래피 분리에 제출됩니다. 시스템은 질량 분석계와 직접 연결되는 나노 흐름 구성입니다. 탠덤 질량 분석법은 하이브리드 이온 트랩(IT) - 푸리에 변환 이온-사이클로트론-공명 질량 분석기에서 수행됩니다. SEQUEST를 검색 엔진으로 사용하여 Proteome Discoverer 소프트웨어(Thermo)로 정량 및 식별 데이터 분석을 수행합니다. 통계 분석 및 데이터 분류는 프리웨어 통계 분석 패키지용 사내 스크립트를 사용하여 수행됩니다.
3. 대식세포, 종양 세포 및 환자 유래 표본의 공동 초점 현미경 분석. 분석은 흉막 삼출액(이전에 설명한 대로)과 동결 및 파라핀 내장 조직에서 파생된 세포 구성 요소에 대해 수행됩니다. Immunofluorescence 염색은 DNA 손상 및 극성 염증의 마커로 수행됩니다. 또한, 질량 분석 연구에서 얻은 추정되는 새로운 MM 분자 마커를 검증하기 위해 면역형광 분석을 실시할 것입니다.