Análise Prospectiva Observacional das Características Biológicas de Pacientes com Mesotelioma

Esta é uma análise prospectiva observacional das características biológicas de pacientes com mesotelioma pleural maligno (MPM). Espécimes tumorais congelados e embebidos em parafina e derrame pleural de pacientes serão coletados e analisados ​​com as seguintes análises:

1. Purificação de TAMs e células tumorais de derrames pleurais. Os derrames pleurais serão submetidos à centrifugação para separação dos componentes celulares e não celulares. O sobrenadante livre de células será coletado e submetido a análises adicionais para identificação e caracterização das proteínas secretadas (ELISA, Western Blot). Os componentes das células do derrame pleural serão caracterizados por citofluorimetria para avaliar a composição dos leucócitos (ex. macrófagos, neutrófilos, linfócitos). Em seguida, para isolar TAMs dos componentes celulares, os investigadores adotarão um protocolo padrão atualmente realizado no grupo de investigadores para purificar TAMs de ascite derivada de pacientes com carcinoma ovariano. Resumidamente, os TAMs serão separados por sua capacidade seletiva de aderir em placas de cultura em condições livres de soro. Após 1 hora de incubação, as células não aderentes (principalmente células tumorais e outras células inflamatórias) serão cuidadosamente lavadas com jatos de meio. Após a adesão, as células foram deixadas em repouso por 1 hora em condições de cultura padrão e subsequentemente lisadas para extrair proteínas. Para isolar as células tumorais dos leucócitos, será utilizada uma abordagem baseada na separação de células. Resumidamente, as células inflamatórias serão coradas com anticorpo do antígeno comum de linfócitos (CD45) e as células negativas (células tumorais) serão separadas por classificação celular. Em seguida, as células tumorais serão cultivadas e amplificadas em condições de cultura padrão.
2. Análise por espectrometria de massa de TAMs e células tumorais A geração de proteoma e os mapas fosfoproteômicos de TAMs e células tumorais serão realizados pela quantificação de todo o proteoma e do fosfoproteoma. Os resultados obtidos com TAMs serão comparados com macrófagos derivados de Monócitos (M-DM) polarizados M1 e M2 não tratados, enquanto células tumorais purificadas de derrame pleural de pacientes serão analisadas em relação a células mesoteliais humanas. Amostras de proteínas obtidas dos TAMs purificados e células tumorais, derivadas de derrames pleurais do paciente, serão extraídas por lise/precipitação com acetona. Os extratos celulares serão posteriormente submetidos à digestão com tripsina e os peptídeos resultantes serão marcados com os reagentes "iTRAQ". Os peptídeos marcados serão separados com a primeira dimensão da separação sendo a cromatografia de troca catiônica forte (SCX). As frações serão coletadas e enriquecidas com fosfo, quando necessário. A mistura reunida de peptídeos será submetida a uma separação cromatográfica de segunda dimensão, organizada em um processo de duas etapas: uma pré-coluna de dessalinização/concentração e uma coluna analítica para a separação. O sistema é uma configuração de nanofluxo, com interface direta com um espectrômetro de massa. A espectrometria de massa em tandem será realizada em um espectrômetro de massa híbrido ion-trap (IT) - transformada de Fourier íon-cíclotron-ressonância. A análise dos dados quantitativos e de identificação será realizada com o software Proteome Discoverer (Thermo), utilizando o SEQUEST como buscador. A análise estatística e a classificação dos dados serão realizadas com o auxílio de um roteiro escrito interno para o pacote de análise estatística freeware.
3. Análise de microscopia co-focal de macrófagos, células tumorais e espécimes derivados de pacientes. A análise será realizada nos componentes celulares derivados de derrame pleural (como descrito anteriormente) e de tecidos congelados e embebidos em parafina. A coloração de imunofluorescência será realizada com marcadores de dano ao DNA e inflamação polarizada. Além disso, a análise de imunofluorescência será realizada para validar novos marcadores moleculares MM putativos obtidos a partir dos estudos de espectrometria de massas.