Mesotelioomapotilaiden biologisten ominaisuuksien tarkkailuanalyysi

Tämä on havainnollinen prospektiivinen analyysi pahanlaatuista keuhkopussin mesotelioomaa (MPM) sairastavien potilaiden biologisista ominaisuuksista. Jäädytetyt ja parafiiniin upotetut kasvainnäytteet ja potilaiden pleuraeffuusio kerätään ja analysoidaan seuraavilla analyyseillä:

1. TAM:ien ja kasvainsolujen puhdistus pleuraeffuusioista. Pleuraeffuusiot sentrifugoidaan solujen ja ei-solukomponenttien erottamiseksi. Soluton supernatantti kerätään ja sille suoritetaan lisäanalyysi erittyneiden proteiinien tunnistamiseksi ja karakterisoimiseksi (ELISA, Western Blot). Pleuraeffuusiosolukomponentit karakterisoidaan sytofluorimetrialla leukosyyttien koostumuksen arvioimiseksi (esim. makrofagit, neutrofiilit, lymfosyytit). Seuraavaksi TAM:ien eristämiseksi solukomponenteista tutkijat ottavat käyttöön tutkijaryhmässä tällä hetkellä suoritettavan standardin protokollan TAM:ien puhdistamiseksi munasarjasyöpäpotilaista peräisin olevista askiteista. Lyhyesti sanottuna TAM:t erotetaan niiden selektiivisen kyvyn perusteella tarttua viljelylevyihin seerumittomissa olosuhteissa. 1 tunnin inkubaation jälkeen kiinnittymättömät solut (pääasiassa kasvainsolut ja muut tulehdussolut) pestään perusteellisesti pois alustasuihkuilla. Kiinnittymisen jälkeen soluja pidettiin 1 tunnin ajan normaaleissa viljelyolosuhteissa ja lyysattiin sen jälkeen proteiinien uuttamiseksi. Kasvainsolujen eristämiseksi leukosyyteistä käytetään solulajitteluun perustuvaa lähestymistapaa. Lyhyesti sanottuna tulehdussolut värjätään lymfosyyttien yhteisen antigeenin (CD45) vasta-aineella ja negatiiviset solut (kasvainsolut) erotetaan solulajittelulla. Seuraavat kasvainsolut kasvatetaan ja monistetaan normaaleissa viljelyolosuhteissa.
2. TAM:ien ja kasvainsolujen massaspektrometria-analyysi Proteomin ja TAM:ien ja kasvainsolujen fosfoproteomiset kartat saadaan aikaan kvantitoimalla sekä koko proteomi että fosfoproteomi. TAM:illa saatuja tuloksia verrataan käsittelemättömiin, M1- ja M2-polarisoituneisiin monosyyteistä peräisin oleviin makrofageihin (M-DM), kun taas potilaiden keuhkopussin effuusiosta puhdistettuja kasvainsoluja analysoidaan suhteessa ihmisen mesotelisoluihin. Puhdistetuista TAMeista ja kasvainsoluista saadut proteiininäytteet, jotka on johdettu potilaan keuhkopussin effuusioista, uutetaan käyttämällä lyysi/asetonisaostusta. Soluuutteet altistetaan tämän jälkeen trypsiinidigestiolle ja saadut peptidit leimataan "iTRAQ"-reagensseilla. Leimatut peptidit erotetaan siten, että erotuksen ensimmäinen ulottuvuus on vahva kationinvaihtokromatografia (SCX). Fraktiot kerätään ja fosforikastetaan tarvittaessa. Yhdistetylle peptidiseokselle suoritetaan toisen ulottuvuuden kromatografinen erotus, joka on järjestetty kaksivaiheisena prosessina: suolanpoisto/väkevöintiesikolonni ja analyyttinen pylväs erotusta varten. Järjestelmä on nanovirtauskokoonpano, jossa on suora liitäntä massaspektrometriin. Tandemmassaspektrometria suoritetaan hybridi-ioniloukun (IT) - Fourier-muunnos-ioni-syklotroni-resonanssimassaspektrometrillä. Kvantitatiivinen ja tunnistustietojen analyysi suoritetaan Proteome Discoverer -ohjelmistolla (Thermo) käyttämällä hakukoneena SEQUESTiä. Tilastollinen analyysi ja tietojen luokittelu toteutetaan ilmaisen tilastoanalyysipaketin omalla kirjallisella skriptillä.
3. Makrofagien, kasvainsolujen ja potilaista peräisin olevien näytteiden co-focal-mikroskooppianalyysi. Analyysi suoritetaan solukomponenteilla, jotka ovat peräisin keuhkopussin effuusiosta (kuten aiemmin on kuvattu) ja jäädytetyistä ja parafiiniin upotetuista kudoksista. Immunofluoresenssivärjäys suoritetaan DNA-vaurion ja polarisoituneen tulehduksen merkkiaineilla. Lisäksi suoritetaan immunofluoresenssianalyysi massaspektrometriatutkimuksista saatujen oletettujen uusien MM-molekyylimarkkerien validoimiseksi.