만성 신장 질환이 없는 빈혈에서 FGF23 및 심혈관 손상.

1 연구 모집단 1.1) 신장 기능이 정상인 철결핍성 빈혈 환자를 대상으로 한 연구. 연구는 환자의 혈청 샘플에서 수행됩니다. 모든 환자에게 해당 정보에 입각한 동의서가 제공됩니다.

18세 이상, 정상 신기능(GFR> 60ml/min/1.73m2), 헤모글로빈 수치 <11g/dl, 혈청 페리틴 수치 <100ng/dL 또는 트랜스페린 포화율 <30%인 환자. 치료 또는 활동성 악성 종양, 증식성 혈액 질환 또는 영양실조(BMI <17)의 병력이 있거나 경구 철분 치료를 받고 있거나 장 출혈이 있거나 지난 90일 이내에 수혈을 받은 환자는 연구에서 제외됩니다.

1.1.2) 빈혈 및 CKD 환자에 대한 연구. 이 연구는 18세 이상, 헤모글로빈 수치 <11g/dl, 혈청 페리틴 수치 <100ng/dL 또는 트랜스페린 포화도 <30%의 기준을 충족하는 빈혈이 있거나 없는 신장 질환의 3기 및 4기 환자를 포함합니다. 심각한 단백뇨, 치료 중이거나 활동성 악성 종양의 증상, 염증성 류마티스 질환, HIV 양성, B형 또는 C형 간염 바이러스가 있는 환자, 쿠마린 또는 적혈구 생성 자극제로 항응고 요법을 받고 있는 환자, 대수술을 받았거나 심혈관 사건이 있었던 환자, 연구 시작 전 마지막 3개월 동안 장 출혈 또는 수혈을 받은 사람은 제외됩니다.

연구 개발에 필요한 표본 크기와 관련하여, CKD가 없는 철결핍성 빈혈 환자 모집단의 경우 183명, 빈혈 및 CKD 환자를 대상으로 한 연구의 경우 218명의 무작위 표본이 고려됩니다. , 95% 신뢰도와 +/- 5% 단위의 정확도로 각각 약 13%와 15%가 될 것으로 예상되는 모집단 백분율을 추정하기에 충분할 것입니다. 필요한 교체 비율로 각각 5%와 10%가 될 것으로 예상됩니다. 1.2. 결정 환자를 위한 황산제일철 또는 카르복시말토스 제2철이 될 철분 보충 시작 후 12개월이 되는 초기 시간(치료를 받기 전)에 단순 혈액을 채취합니다. 혈액 샘플은 즉시 3500rpm에서 10' 동안 원심분리되고 다른 연구 매개변수의 분석까지 -80°C에서 저장됩니다. Ca, 크레아티닌, 요소, 인, 알부민, 헤모글로빈, 페리틴 및 철 포화도 수준은 표준화되고 자동화된 상업적 분석(Beckman AU)을 사용하여 결정되며, 처리될 것입니다. 온전한 C-말단 FGF23 수준의 결정은 E.L.I.S.A. Kainos Laboratories 키트, 일본 및 Immutopics, CA를 각각 사용합니다. PTH 수준의 분석을 위해 온전한 PTH 키트(Immutopics, CA)가 사용됩니다. 헵시딘은 ELISA(Elabsciences, USA)에 의해 결정될 것이다. 25(OH)D의 수준은 방사면역측정법(RIA)(Immunodiagnostic Systems, UK)에 의해 결정될 것이다. 신장 기능은 혈청 크레아티닌, 연령, 성별 및 인종을 변수로 포함하는 CKD-EPI(Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration) 공식을 사용하여 사구체 여과율(eGFR)을 계산하여 수행됩니다. ELISA 키트는 뇌 나트륨 이뇨 펩타이드(BNP), 미오글로빈 및 트로포닌의 순환 수준을 정량적으로 측정하는 데 사용되며, I(Thermofisher Scientific) 및 Bioplex는 분비 사이토카인 수준을 결정하는 데 사용됩니다. 혈장 내 산화 스트레스 측정을 위해 Flohé와 Günzler의 방법을 사용하여 효소 glutathione peroxidase(GPX)의 활성을 분석합니다.

CKD가 있거나 없는 빈혈 환자의 혈장에서 비암호화 전사체 프로필(microRNA)의 최신 기술을 사용하고 이러한 병리의 임상 및 분석 프로필과의 연관성을 확립합니다. miRNA 프로필 연구는 Illumina SE50 플랫폼(Novogene enterprise, Cambridge Science Park, UK)으로 수행됩니다. 이 연구는 철분 결핍이 있고 신부전이 있거나 없는 환자의 혈장 샘플에서 수행됩니다. DEGseq R 패키지는 미분 표현을 식별하는 데 사용됩니다. 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석은 알려지고 새로운 miRNA의 예측된 표적 유전자 후보에 사용될 것입니다. KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 분석은 차별적으로 발현된 miRNA 표적 유전자와 관련된 상당히 풍부한 대사 경로 또는 신호 전달 경로를 식별하는 데 사용될 것입니다. 표본의 대표 수(대조군을 포함하여 각 실험 상황에서 n = 15명의 환자)가 고려됩니다. 얻은 데이터를 검증하기 위해 차등적으로 발현된 선택된 miRNA의 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행합니다. 얻은 결과는 통계적으로 분석되어 임상 및 분석 매개변수와의 가능한 상관관계 및 연관성을 찾습니다.

질량 분석법에 의한 단백질체 분석 및 이러한 병리학의 임상 및 분석 매개변수와의 연관성. 질량 분석법(MS)은 시료의 원자 또는 분자를 이온화하고 질량/전하 비율(m/z)에 따라 분리한 다음 검출 및 기록하는 분석 기술입니다. 단백질 연구를 수행하기 위해, 위에서 설명한 환자 집단의 혈청)을 고갈시켜 대부분의 단백질을 제거합니다. 단백질 정량 후 샘플은 프로테옴 분석이 수행될 때까지 -80에 보관됩니다. 샘플을 적절하게 처리하고 얻은 트립신 펩타이드를 질량 분석법(nHPLC-MS)과 결합된 액체 나노크로마토그래피(역상)로 분석하여 연구된 여러 조건 사이의 단백질의 상대적 존재비를 정량화합니다. 이를 위해 SWATH(Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra) 획득 모드에서 작동하는 질량 분석계(Triple TOF 5600 + 모델, ABSciex)를 사용합니다. 대표적인 샘플 수(대조군을 포함하여 각 실험 상황에서 n = 15명의 환자가 고려됨).

2. CKD 유무에 관계없이 빈혈의 생쥐 실험 모델에서 철 결핍 유발인자(hepcidin)의 조절(억제) 및 FGF23(HIF1alpha)의 증가가 심혈관 손상 지표에 미치는 영향을 생체 내에서 평가하기 위해. 실험은 동물 복지에 관한 현행 국가 규정(BOE No. 256 of 10/25/90; Amendment Protocol to the agreement 123; 2)에 따라 야생형 Wistar 쥐(프랑스 찰스 리버)로 수행될 것입니다. /2005년 12월). Wistar 쥐는 정상 철분 함량(대조군, 45mg/kg 식이) 또는 낮은 철 함량(빈혈군, 5mg/Kg 식이)의 식이를 먹일 것입니다. CKD. 다이어트에는 표준 인산염 농도가 포함됩니다. 식이는 이유 후, 21-24일령에 시작되며 임의로 제공됩니다. 쥐는 실험 종료 시점까지 8주 동안 식단을 유지합니다. 추가 동물 그룹은 각각 HIF1α(2-메톡시에스트라디올 25μg/g) 억제제(Selleckchem-Pfizer, USA) 또는 헵시딘 억제제(AG490, 15mg/Kg)(Calbiochem)의 복강내 주사를 받을 것입니다. 동물 사료는 Altromin(독일)에서 구입합니다. 안락사 시 수사관은 전혈, 소변, 심장을 적출합니다. 혈액은 혈장과 혈청을 분리하기 위해 즉시 처리되며 -80 ° C.2.1.1에 보관됩니다. 생화학적 매개변수 혈청 크레아티닌, 인산염 및 칼슘은 비색 방법(Biosystems)으로 측정됩니다. 혈청 헵시딘은 ELISA(Elabsciecne)에 의해 측정될 것이다. 혈청 비타민 D는 RIA(Immunodiagnostics Systems, UK)에 의해 결정됩니다. 혈청 온전한 부갑상선 호르몬(iPTH), 혈장 C-말단 FGF23(cFGF23) 및 혈장 온전한 FGF23(iFGF23), 헵시딘 농도는 설치류 특이적 ELISA 키트(Immutopics, CA)를 사용하여 분석할 것입니다. 페리틴 수준은 마우스 ELISA(Abcam, USA)에 의해 결정될 것이다; 혈청 철은 분광 광도계로 측정됩니다(Pointe Scientific USA). BNP, 미오글로빈 및 트로포닌 I은 ELISA(Thermofisher Scientific)에 의해 평가될 것입니다.

2.1. Molecular Imaging(MALDI IMAGING)을 통한 심장 조직의 단백질 국소화. 이전에 파라핀 처리된 심장은 마이크로톰으로 최대 5um 두께로 절단되고 이전에 폴리리신으로 수정된 전도성 결정에 증착됩니다. 그 후 조직의 표준화된 탈왁스/재수화 처리가 수행됩니다. 조직 소화는 분무기에 의해 증착된 트립신으로 수행될 것이며, 그 후 가장 적합한 매트릭스가 증착되어 생성된 펩티드의 분석을 수행하기 위해 질량 분석기 유형 MALDI-TOF/TOF(모델 5800 TOF/TOF, 모델 5800 TOF/TOF, ABSciex).

2.2. 생체 내 비교를 위해, CKD가 있거나 없는 빈혈의 실험 모델에서 FGF23 수준에 미치는 영향과 다양한 철 제시(황산제일철, 카르복시말토오스 제2철 및 시트르산 제2철)의 심혈관 영향을 비교합니다. 조사관은 FGF23 생산뿐만 아니라 심혈관 마커의 발현에 대한 다양한 철 기반 제형(카르복시말토오스 제2철(Ferinject-Vifor Pharma), 구연산 제2철 및 황산 제1철(둘 다 Sigma 제품))의 효과를 확인할 것입니다. 제한된 빈혈 및 CKD 모델은 이전에 지정된 것과 동일합니다(섹션 2.1). 철 기반 제제는 정맥 주사로 투여됩니다. 쥐는 단일 i.v.를 받게 됩니다. 4주 동안 매 7일마다 해당 철 화합물(40 mg/kg 체중) 또는 대조군 용액(등가 부피)을 꼬리 정맥 주사로 동시에 투여합니다. 치료 용량은 각 동물의 체중에 따라 매주 조정됩니다. 안락사 시 조사관은 전혈을 수집하여 즉시 처리하여 -80°C에 보관하고 2.1.1절에 명시된 생화학 분석을 수행합니다. 심장을 수확하여 100% 에탄올에 고정하고 파라핀에 내장합니다. R.S.의 병리학적 해부학 서비스와 관련하여 조직학적 연구가 수행될 것입니다. 병원. 한편, 몇몇 연구는 FGF23에 대한 PTH의 직접적인 영향을 설명하고 있으며 매우 최근의 데이터는 Carboxymaltose 투여 후 PTH 수준의 증가를 보여줍니다. 따라서 FGF23 수준에 대한 Carboxymaltose의 효과가 PTH를 통해 매개되는지 여부를 평가하기 위해 연구자는 Wistar 쥐를 대상으로 선택적 부갑상선 절제술(PTX)을 수행하고 Minipump로 Carboxymaltose ± PTH 4X를 주입할 연구를 수행할 것입니다. 14일 동안 Alzet 모델 2ML4 삼투압 미니펌프(Charles River Laboratories, Barcelona, ​​Spain). PTH, FGF23i 및 FGF23c의 수준이 결정됩니다.

통계 분석. 연속 변수는 학생의 "t" 및 분산 분석(ANOVA)에 의해 비교됩니다. 이러한 변수가 정규 분포를 따르지 않는 경우 관련 데이터 변환이 적용되고 비모수 테스트가 분석됩니다. 범주형 변수 간의 연관성은 카이제곱 테스트를 사용하여 분석됩니다. 이러한 데이터의 다변량 분석을 위해 Kaplan-Meier Curves 분석, 조건부 로지스틱 회귀 및 Cox 회귀의 통계 절차를 평가합니다.