FGF23 en cardiovasculaire schade bij bloedarmoede met een zonder chronische nierziekte.

1 Studiepopulaties 1.1) Studie bij patiënten met bloedarmoede door ijzertekort met een normale nierfunctie. De studie zal worden uitgevoerd in de serummonsters van patiënten. Alle patiënten krijgen de bijbehorende geïnformeerde toestemming.

Patiënten met een leeftijd ≥18 jaar, normale nierfunctie (GFR> 60 ml / min / 1,73 m2), hemoglobinewaarden <11 g / dl, serum-ferritinewaarden <100 ng / dL of verzadigingspercentage van transferrine <30%. Patiënten met een voorgeschiedenis van behandelde of actieve maligniteiten, proliferatieve hematologische aandoeningen of tekenen van ondervoeding (BMI <17), die een orale ijzerbehandeling krijgen, of die een darmbloeding hebben gehad of een bloedtransfusie hebben gekregen in de afgelopen 90 dagen, zullen worden uitgesloten van de studie.

1.1.2) Studie bij patiënten met bloedarmoede en CKD. Deze studie omvat patiënten met nierziekte stadium 3 en 4 met of zonder bloedarmoede die voldoen aan de criteria: leeftijd ≥18 jaar, hemoglobinewaarden <11 g/dl, serum-ferritinewaarden <100 ng/dl of percentage transferrineverzadiging <30%. Patiënten met ernstige proteïnurie, symptomen van behandelde of actieve maligniteit, inflammatoire reumatische aandoeningen, hiv-positiviteit, hepatitis B- of C-virus, die anticoagulantia krijgen met coumarine of een erytropoëse-stimulerend middel, die een grote operatie hebben ondergaan of een cardiovasculair voorval hebben gehad, darmbloeding of een bloedtransfusie ontvangen in de laatste 3 maanden voorafgaand aan de start van de studie worden uitgesloten.

Met betrekking tot de steekproefomvang die nodig is voor de ontwikkeling van het onderzoek, wordt ervan uitgegaan dat een willekeurige steekproef van 183 personen voor de populatie van patiënten met bloedarmoede door ijzertekort zonder CKD en 218 voor het onderzoek dat moet worden uitgevoerd met patiënten met anemie en CKD , zal voldoende zijn om, met een betrouwbaarheid van 95% en een nauwkeurigheid van +/- 5 procenteenheden, een bevolkingspercentage te schatten dat naar verwachting respectievelijk rond de 13% en 15% zal liggen. Als percentage van de noodzakelijke vervangingen is dit naar verwachting respectievelijk 5% en 10%. 1.2. Bepalingen Er zal op het eerste moment (vóór de behandeling) een eenvoudig bloed worden afgenomen, 12 maanden na het begin van ijzersuppletie, voor patiënten ijzersulfaat of ijzer(III)carboxymaltose. Het bloedmonster wordt onmiddellijk gecentrifugeerd bij 3500 rpm gedurende 10 'en opgeslagen bij -80 ° C tot de analyse van de verschillende studieparameters. De niveaus van Ca, creatinine, ureum, fosfor, albumine, hemoglobine, ferritine en ijzerverzadigingsniveaus zullen worden bepaald met behulp van gestandaardiseerde en geautomatiseerde commerciële assays (Beckman AU), die zullen worden verwerkt. De bepaling van intacte en C-terminale FGF23-niveaus zal worden uitgevoerd door E.L.I.S.A. met behulp van respectievelijk de Kainos Laboratories-kit, Japan en Immutopics, CA. Voor de analyse van PTH-waarden wordt de intacte PTH-kit (Immutopics, CA) gebruikt. Hepcidine zal worden bepaald door ELISA (Elabsciences, VS). De niveaus van 25 (OH) D zullen worden bepaald door radioimmunoassay (RIA) (Immunodiagnostic Systems, VK). De nierfunctie wordt bepaald door de glomerulaire filtratiesnelheid (eGFR) te berekenen met behulp van de CKD-EPI-formule (Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration), die serumcreatinine, leeftijd, geslacht en ras als variabelen omvat. ELISA-kits zullen worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van circulerende niveaus van brain natriuretic peptide (BNP), myoglobine en troponine, I, (Thermofisher Scientific) en Bioplex om de niveaus van uitgescheiden cytokines te bepalen. Voor de bepaling van oxidatieve stress in plasma zal de activiteit van het enzym glutathionperoxidase (GPX) worden geanalyseerd, volgens de methode van Flohé en Günzler.

Vaststelling, door het gebruik van de nieuwste technologie van het niet-coderende transcriptomische profiel (microRNA's) in het plasma van anemische patiënten zonder of met CKD en de associatie ervan met het klinische en analytische profiel van deze pathologieën. miRNAs-profielonderzoek zal worden uitgevoerd met het Illumina SE50-platform (Novogene enterprise, Cambridge Science Park, VK). De studie zal worden uitgevoerd met plasmamonsters van patiënten met een ijzertekort en met of zonder nierfalen. Het pakket DEGseq R wordt gebruikt voor het identificeren van een differentiële uitdrukking. Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse zal gebruikt worden op voorspelde doelwitgenkandidaten van bekende en nieuwe miRNA's. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway-analyse zal worden gebruikt voor het identificeren van significant verrijkte metabole routes of signaaltransductieroutes geassocieerd met differentieel tot expressie gebrachte miRNA-doelgenen. Er zal een representatief aantal monsters (n = 15 patiënten uit elke experimentele situatie inclusief controlepersonen) worden overwogen. Om de verkregen gegevens te valideren, zal een real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) van de geselecteerde miRNAS, differentieel uitgedrukt, worden uitgevoerd. De verkregen resultaten zullen statistisch worden geanalyseerd om mogelijke correlaties en associaties met klinische en analytische parameters te vinden.

Proteomische analyse door massaspectrometrie en de associatie ervan met de klinische en analytische parameters van deze pathologieën. Massaspectrometrie (MS) is een analytische techniek waarbij de atomen of moleculen van een monster worden geïoniseerd, gescheiden op basis van hun massa/ladingverhouding (m/z) en vervolgens worden gedetecteerd en geregistreerd. Om de proteomische studie uit te voeren, zullen de sera van de hierboven beschreven patiëntenpopulaties worden uitgeput om de meeste eiwitten te elimineren. Na een eiwitkwantificering worden de monsters bij -80°C bewaard totdat de proteomische analyse wordt uitgevoerd. Het monster zal op de juiste manier worden behandeld en de verkregen tryptische peptiden zullen worden geanalyseerd door middel van vloeibare nanochromatografie (omgekeerde fase) gekoppeld aan massaspectrometrie (nHPLC-MS) om de relatieve hoeveelheid eiwitten tussen de verschillende bestudeerde omstandigheden te kwantificeren. Hiervoor zal een massaspectrometer (Triple TOF 5600 + model, ABSciex) worden gebruikt die werkt in de SWATH (Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra) acquisitiemodus. Er zal een representatief aantal monsters (n = 15 patiënten uit elke experimentele situatie inclusief controlepersonen) worden overwogen).

2. Om in vivo te evalueren, in een muisexperimenteel model van bloedarmoede, zonder of met CKD, de effecten van de modulatie (remming) van triggers voor ijzertekort (hepcidine) en van de toename van FGF23 (HIF1alpha) op markers van cardiovasculaire schade. De experimenten zullen worden uitgevoerd met wildtype Wistar-ratten (Charles River, Frankrijk) in overeenstemming met de huidige nationale regels over dierenwelzijn (BOE nr. 256 van 25-10-90; Wijzigingsprotocol bij de overeenkomst 123; 2 /12/2005). Wistar-ratten krijgen een dieet met ofwel een normaal ijzergehalte (controlegroep, 45 mg / kg dieet) of een laag ijzergehalte (bloedarmoedegroep, 5 mg / kg dieet) zonder of met adenine (0,2% wt/w), wat induceert CKD. Diëten bevatten standaard fosfaatconcentraties. Diëten beginnen na het spenen, op een leeftijd van 21-24 dagen, en worden ad libitum verstrekt. Ratten zullen gedurende 8 weken op het dieet staan, tot het experimentele eindpunt. Een andere diergroep krijgt intraperitoneale injecties van respectievelijk een remmer van HIF1α (2-methoxyestradiol 25 μg/g) (Selleckchem-Pfizer, VS) of van een remmer van hepcidine (AG490, 15 mg/kg) (Calbiochem). Diervoeders zullen worden betrokken bij Altromin (Duitsland). Op het moment van euthanasie verzamelen de onderzoekers volbloed, urine en wordt het hart verwijderd. Bloed wordt onmiddellijk verwerkt om plasma en serum te scheiden en wordt bewaard bij -80°C.2.1.1. Biochemische parameters Serumcreatinine, fosfaat en calcium worden gemeten met colorimetrische methoden (Biosystems). Serumhepcidine zal worden gemeten met ELISA (Elabsciecne). Serum vitamine D zal worden bepaald door RIA (Immunodiagnostics Systems, VK). Serum intact parathyroïde hormoon (iPTH), plasma C-terminaal FGF23 (cFGF23) en plasma intact FGF23 (iFGF23), hepcidineconcentraties zullen worden getest met behulp van knaagdierspecifieke ELISA-kits (Immutopics, CA). Ferritineniveaus zullen worden bepaald met muizen-ELISA (Abcam, VS); serumijzer zal spectrofotometrisch worden gemeten (Pointe Scientific USA). BNP, myoglobine en troponine I zullen worden geëvalueerd door ELISA (Thermofisher Scientific).

2.1. Lokalisatie van eiwitten in hartweefsel door middel van Molecular Imaging (MALDI IMAGING). De eerder geparaffineerde harten worden gesneden met een microtoom tot een maximale dikte van 5um en gedeponeerd in geleidende kristallen die eerder zijn gemodificeerd met polylysine. Vervolgens zal een gestandaardiseerde ontparaffinerings-/rehydratatiebehandeling van het weefsel worden uitgevoerd. De weefseldigestie zal worden uitgevoerd met trypsine gedeponeerd door een sproeier en daarna zal de meest geschikte matrix worden gedeponeerd om de analyse van de gegenereerde peptiden uit te voeren door middel van massaspectrometrie met behulp van een massaspectrometer type MALDI-TOF /TOF (model 5800 TOF / TOF, ABSiex).

2.2. Om in vivo, in een experimenteel model van bloedarmoede met en zonder CKD, het effect op FGF23-niveaus en de cardiovasculaire impact van verschillende ijzerpresentaties (ijzersulfaat, ijzercarboxymaltose en ijzercitraat) te vergelijken. De onderzoekers zullen het effect van verschillende formuleringen op ijzerbasis (carboxymaltose-ijzer (Ferrinject-Vifor Pharma), ijzercitraat en ijzersulfaat (beide van Sigma)) op de expressie van cardiovasculaire markers en op de productie van FGF23 controleren. beperkte anemie- en CKD-modellen zullen dezelfde zijn als eerder gespecificeerd (rubriek 2.1). De preparaten op ijzerbasis zullen intraveneus worden toegediend. Ratten krijgen een enkele i.v. dosis door injectie in de staartader van de overeenkomstige ijzerverbinding (40 mg / kg lichaamsgewicht) of controleoplossing (equivalent volume) op hetzelfde tijdstip om de 7 dagen gedurende 4 weken. De behandelingsdoses zullen elke week worden aangepast op basis van het lichaamsgewicht van elk dier. Op het moment van euthanasie verzamelen de onderzoekers volbloed, dat onmiddellijk wordt verwerkt en bewaard bij -80 ° C, en voeren ze de biochemische analyse uit zoals gespecificeerd in paragraaf 2.1.1. Hart wordt geoogst, gefixeerd in 100% ethanol en ingebed in paraffine. Er zal een histologisch onderzoek worden uitgevoerd in samenwerking met de dienst pathologische anatomie van R.S. Ziekenhuis. Aan de andere kant beschrijven verschillende onderzoeken een direct effect van PTH op FGF23 en zeer recente gegevens tonen een toename van PTH-spiegels na toediening van carboxymaltose. Om te beoordelen of het effect van carboxymaltose op FGF23-niveaus wordt gemedieerd door PTH, zullen de onderzoekers dus studies uitvoeren met Wistar-ratten, waarbij we een selectieve parathyroïdectomie (PTX) zullen uitvoeren en carboxymaltose ± PTH 4X zullen infunderen met een minipomp ( Alzet model 2ML4 osmotische minipomp (Charles River Laboratories, Barcelona, ​​Spanje) gedurende 14 dagen. De niveaus van PTH, FGF23i en FGF23c zullen worden bepaald.

STATISTISCHE ANALYSE. Continue variabelen worden vergeleken door Student's "t" en door Variantieanalyse (ANOVA). In het geval dat deze variabelen geen normale verdeling zouden volgen, wordt de relevante transformatie van de gegevens toegepast en worden niet-parametrische tests getest. De associatie tussen categorische variabelen zal worden geanalyseerd met behulp van de chikwadraattoets. Voor de multivariate analyse van deze gegevens zullen de statistische procedures van Kaplan-Meier Curves-analyse, voorwaardelijke logistische regressie en Cox-regressie worden geëvalueerd.