FGF23 e dano cardiovascular na anemia com e sem doença renal crônica.

1 Populações do estudo 1.1) Estudo em pacientes com anemia por deficiência de ferro com função renal normal. O estudo será realizado nas amostras de soro dos pacientes. Todos os pacientes receberão o correspondente consentimento informado.

Pacientes com idade ≥18 anos, função renal normal (TFG > 60 ml/min/1,73m2), níveis de hemoglobina <11 g/dl, níveis séricos de ferritina <100ng/dL ou percentual de saturação de transferrina <30%. Pacientes com histórico de malignidade ativa ou tratada, distúrbios hematológicos proliferativos ou evidência de desnutrição (IMC <17), que estão recebendo tratamento oral com ferro, ou que tiveram sangramento intestinal ou receberam transfusão de sangue nos últimos 90 dias, serão ser excluído do estudo.

1.1.2) Estudo em pacientes com anemia e DRC. Este estudo incluirá pacientes com estágio 3 e 4 de doença renal com ou sem anemia que atendam aos critérios: idade ≥18 anos, níveis de hemoglobina <11 g/dl, níveis séricos de ferritina <100ng/dL ou porcentagem de saturação de transferrina <30%. Pacientes com proteinúria grave, sintomas de malignidade tratada ou ativa, doenças reumáticas inflamatórias, HIV positivo, vírus da hepatite B ou C, que estejam recebendo anticoagulação com cumarina ou qualquer agente estimulante da eritropoiese, que tenham sido submetidos a uma cirurgia de grande porte ou que tenham tido um evento cardiovascular, sangramento intestinal ou receberam transfusão de sangue nos últimos 3 meses antes do início do estudo serão excluídos.

Em relação ao tamanho amostral necessário para o desenvolvimento do estudo, considera-se uma amostra aleatória de 183 indivíduos para a população de pacientes com anemia ferropriva sem DRC e 218 para o estudo a ser realizado com pacientes com anemia e DRC , serão suficientes para estimar, com uma confiança de 95% e uma precisão de +/- 5 unidades percentuais, uma percentagem populacional que se espera rondar os 13% e os 15%, respetivamente. Como percentual de substituições necessárias, espera-se que seja de 5% e 10%, respectivamente. 1.2. Determinações Será coletado sangue simples no momento inicial (antes de receber o tratamento), 12 meses após o início da suplementação de ferro, que será sulfato ferroso ou carboximaltose férrica para os pacientes. A amostra de sangue será centrifugada imediatamente a 3500 r.p.m por 10' e armazenada a -80°C até a análise dos diferentes parâmetros do estudo. Serão determinados os níveis de Ca, creatinina, uréia, fósforo, albumina, hemoglobina, ferritina e níveis de saturação de ferro, utilizando ensaios comerciais padronizados e automatizados (Beckman AU), que serão processados. A determinação dos níveis de FGF23 intacto e C-terminal será realizada por E.L.I.S.A. usando o kit Kainos Laboratories, Japão e Immutopics, CA, respectivamente. Para a análise dos níveis de PTH, será utilizado o Kit PTH íntegro (Immutopics, CA). A hepcidina será determinada por ELISA (Elabsciences, EUA). Os níveis de 25 (OH) D serão determinados por radioimunoensaio (RIA) (Immunodiagnostic Systems, Reino Unido). A função renal será realizada pelo cálculo da taxa de filtração glomerular (eGFR) usando a fórmula CKD-EPI (Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration), que inclui creatinina sérica, idade, sexo e raça como variáveis. Os kits ELISA serão utilizados para a determinação quantitativa dos níveis circulantes de peptídeo natriurético cerebral (BNP), mioglobina e troponina, I, (Thermofisher scientific) e Bioplex para determinação dos níveis de citocinas secretadas. Para a determinação do estresse oxidativo no plasma, será analisada a atividade da enzima glutationa peroxidase (GPX), utilizando o método de Flohé e Günzler.

Estabelecimento, através da utilização de tecnologia de ponta do perfil transcriptômico não codificante (microRNAs) no plasma de pacientes anêmicos sem ou com DRC e sua associação com o perfil clínico e analítico dessas patologias. O estudo do perfil de miRNAs será realizado com a plataforma Illumina SE50 (Empresa Novogene, Cambridge Science Park, Reino Unido). O estudo será realizado a partir de amostras de plasma de pacientes com déficit de ferro e com ou sem insuficiência renal. O pacote DEGseq R será usado para identificar uma expressão diferencial. A análise de enriquecimento de ontologia genética (GO) será usada em candidatos de gene alvo previstos de miRNAs conhecidos e novos. A análise de vias da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) será usada para identificar vias metabólicas significativamente enriquecidas ou vias de transdução de sinal associadas a genes alvo de miRNA expressos diferencialmente. Um número representativo de amostras (n = 15 pacientes de cada situação experimental incluindo controles) será considerado. Para validar os dados obtidos, será realizada a reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) dos miRNAS selecionados, expressos diferencialmente. Os resultados obtidos serão analisados ​​estatisticamente para encontrar possíveis correlações e associações com parâmetros clínicos e analíticos.

Análise proteômica por espectrometria de massas e sua associação com os parâmetros clínicos e analíticos dessas patologias. A espectrometria de massa (MS) é uma técnica analítica na qual os átomos ou moléculas de uma amostra são ionizados, separados de acordo com sua relação massa/carga (m/z) e posteriormente detectados e registrados. Para realizar o estudo proteômico, os soros das populações de pacientes descritos acima serão depletados para eliminar as proteínas majoritárias. Após a quantificação das proteínas, as amostras serão armazenadas a -80 até a realização da análise proteômica. A amostra será tratada adequadamente e os peptídeos trípticos obtidos serão analisados ​​por nanocromatografia líquida (fase reversa) acoplada à espectrometria de massas (nHPLC-MS) a fim de quantificar a abundância relativa de proteínas entre as diferentes condições estudadas. Para isso, será utilizado um espectrômetro de massa (modelo Triple TOF 5600+, ABSciex) trabalhando no modo de aquisição SWATH (Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra). Será considerado um número representativo de amostras (n = 15 pacientes de cada situação experimental incluindo controles).

2. Avaliar in vivo, em modelo experimental murino de anemia, sem ou com DRC, os efeitos da modulação (inibição) dos desencadeantes da deficiência de ferro (hepcidina) e do aumento do FGF23 (HIF1alpha) sobre marcadores de dano cardiovascular. Os experimentos serão realizados com ratos Wistar tipo selvagem (Charles River, França) de acordo com as normas nacionais vigentes sobre bem-estar animal (BOE nº 256 de 25/10/90; Protocolo de Emenda ao convênio 123; 2 /12/2005). Ratos Wistar serão alimentados com dieta com teor normal de ferro (grupo controle, 45mg/kg de dieta) ou baixo teor de ferro (grupo anêmico, 5 mg/kg de dieta) sem ou com adenina (0,2% p/p), que induz CKD. As dietas conterão concentrações padrão de fosfato. As dietas serão iniciadas pós-desmame, aos 21-24 dias de idade, e fornecidas ad libitum. Os ratos permanecerão nas dietas por 8 semanas, até o ponto final experimental. Um grupo adicional de animais receberá injeções intraperitoneais de um inibidor de HIF1α (2-metoxiestradiol 25μg/g) (Selleckchem-Pfizer, EUA) ou de um inibidor de hepcidina (AG490, 15mg/Kg) (Calbiochem), respectivamente. As dietas dos animais serão obtidas da Altromin (Alemanha). No momento da eutanásia, os investigadores irão coletar sangue total, urina e o coração será removido. O sangue será processado imediatamente para separar plasma e soro e armazenado a -80°C.2.1.1. Parâmetros Bioquímicos A creatinina sérica, fosfato e cálcio serão medidos por métodos colorimétricos (Biosystems). A hepcidina sérica será dosada por ELISA (Elabsciecne). A vitamina D sérica será determinada por RIA (Immunodiagnostics Systems, Reino Unido). Hormônio paratireoide intacto sérico (iPTH), plasma C-terminal FGF23 (cFGF23) e plasma intacto FGF23 (iFGF23), as concentrações de hepcidina serão analisadas usando kits ELISA específicos para roedores (Immutopics, CA). Os níveis de ferritina serão determinados por ELISA de camundongo (Abcam, EUA); o ferro sérico será medido espectrofotometricamente (Pointe Scientific USA). BNP, mioglobina e troponina I serão avaliados por ELISA (Thermofisher Scientific).

2.1. Localização de proteínas no tecido cardíaco através de Imagem Molecular (MALDI IMAGING). Os corações previamente parafinados serão cortados em micrótomo até a espessura máxima de 5um e depositados em cristais condutores previamente modificados com polilisina. Posteriormente, será realizado um tratamento padronizado de desparafinação/reidratação do tecido. A digestão tecidual será realizada com tripsina depositada por pulverizador e após ela será depositada a matriz mais adequada para realizar a análise dos peptídeos gerados por espectrometria de massas utilizando um espectrômetro de massas tipo MALDI-TOF/TOF (modelo 5800 TOF/TOF, ABSciex).

2.2. Comparar in vivo, em modelo experimental de anemia com e sem DRC, o efeito nos níveis de FGF23 e o impacto cardiovascular de diferentes apresentações de ferro (sulfato ferroso, carboximaltose férrica e citrato férrico). Os investigadores irão verificar o efeito de diferentes formulações à base de ferro (carboximaltose férrica (Ferinject-Vifor Pharma), citrato férrico e sulfato ferroso (ambos da Sigma)) na expressão de marcadores cardiovasculares, bem como na produção de FGF23. O ferro os modelos de anemia restrita e DRC serão os mesmos especificados anteriormente (seção 2.1). As preparações à base de ferro serão administradas por via intravenosa. Os ratos receberão uma única injeção i.v. dose por injeção na veia caudal do composto de ferro correspondente (40 mg / kg de peso corporal) ou solução de controle (volume equivalente) ao mesmo tempo a cada 7 dias durante 4 semanas. As doses do tratamento serão ajustadas semanalmente de acordo com o peso corporal de cada animal. No momento da eutanásia, os investigadores colherão sangue total, que será imediatamente processado e armazenado a -80°C, e realizarão as análises bioquímicas especificadas no item 2.1.1. O coração será colhido, fixado em etanol 100% e embebido em parafina. Será realizado estudo histológico em parceria com o Serviço de Anatomia Patológica do R.S. Hospital. Por outro lado, vários estudos descrevem um efeito direto do PTH sobre o FGF23 e dados muito recentes mostram um aumento dos níveis de PTH após a administração de Carboximaltose. Assim, para avaliar se o efeito da Carboximaltose nos níveis de FGF23 é mediado pelo PTH, os pesquisadores farão estudos com ratos Wistar aos quais faremos uma paratireoidectomia seletiva (PTX) e infundiremos Carboximaltose ± PTH 4X com uma minibomba ( Minibomba osmótica Alzet modelo 2ML4 (Charles River Laboratories, Barcelona, ​​Espanha) por 14 dias. Serão determinados os níveis de PTH, FGF23i e FGF23c.

ANÁLISE ESTATÍSTICA. As variáveis ​​contínuas serão comparadas pelo "t" de Student e pela Análise de Variância (ANOVA). Caso essas variáveis ​​não sigam uma distribuição normal, serão aplicadas as devidas transformações dos dados e testados testes não paramétricos. A associação entre variáveis ​​categóricas será analisada por meio do teste qui-quadrado. Para a análise multivariada desses dados, serão avaliados os procedimentos estatísticos de análise de Curvas de Kaplan-Meier, regressão logística condicional e regressão de Cox.