Badanie bezpieczeństwa/skuteczności szczepionki przeciwko leiszmanii u ochotników bez odpowiedzi na leiszmaninę

Podstawowe informacje Leiszmaniozy obejmują różnorodne objawy kliniczne wywoływane przez różne gatunki pierwotniaków pasożytniczych, Leishmania, przenoszonych przez ukąszenia zakażonych samic muszek piaskowych. Ze względu na różnorodność cech epidemiologicznych kontrola nosicieli i rezerwuarów jest niepraktyczna, kosztowna i zwykle wymaga środowiska politycznego oraz infrastruktury przekraczającej możliwości krajów najbardziej dotkniętych tą chorobą. Celem WHO/TDR było opracowanie bezpiecznej i skutecznej szczepionki, która może być produkowana lokalnie, a tym samym przystępna cenowo dla populacji najbiedniejszych krajów rozwijających się.

Począwszy od lat 30-tych i 40-tych latynoamerykańscy naukowcy stosowali zabite całe pasożyty jako szczepionkę przeciwko leiszmaniozie (1). Różne formy szczepionki, z adiuwantem lub bez, w profilaktyce lub terapii badano w kilku krajach w ciągu ostatnich kilku dekad (2), żadna nie była skuteczna w profilaktyce, ale skuteczność zaobserwowano w immunochemioterapii (3). W ciągu ostatniej dekady wyprodukowaliśmy i przetestowaliśmy różne preparaty uśmierconego L. major plus BCG. Autoklawowany L. major (ALM) zmieszany z BCG (1/10 dawki zwykle stosowanej jako szczepionka przeciwko gruźlicy) był szeroko badany w kilku badaniach klinicznych. Wykazano, że preparat ALM + BCG jest bezpieczny i immunogenny (4-8). Jednak wyniki kilku badań fazy III z pojedynczą lub podwójną dawką tej kandydującej szczepionki przeciwko CL lub VL nie wykazały znaczącej ogólnej ochrony w porównaniu z immunizacją samą BCG (6-8). Nawet trzy wstrzyknięcia nie zapewniały wystarczającej ochrony przed leiszmaniozą skórną (CL).

W celu zwiększenia immunogenności ALM + BCG, ALM adsorbowano na ałunie (wodorotlenek glinu), a otrzymany ałun-ALM zmieszano z BCG w celu wytworzenia nowego preparatu tej szczepionki. Rzeczywiście, dodanie ałunu do ALM prowadzi do zwiększonej immunogenności. Wykazano, że pojedyncza iniekcja ALM w ałunie plus IL-12 indukowała ochronę u małp Rhesus przed CL (10). Podobnie Alum-ALM + BCG chronił małpy Langur przed leiszmaniozą trzewną (11).

Wyniki 2 prób zwiększania dawki pojedynczego śródskórnego wstrzyknięcia ałunu-ALM (10 - 400 ug białek Leishmania) zmieszanego z 1/10 normalnej dawki BCG wykazały najwyższą konwersję testów skórnych zaobserwowaną w dotychczasowych badaniach szczepionki przeciwko Leishmania (12). Parametry bezpieczeństwa ochotników były ściśle monitorowane przez 90 dni po szczepieniu pod kątem miejscowych i ogólnoustrojowych skutków ubocznych. Działania niepożądane były minimalne i ograniczone do miejsca wstrzyknięcia. Nie odnotowano żadnych ogólnoustrojowych skutków ubocznych. W drugim badaniu sponsorowanym przez TDR w Sudanie przetestowano 10, 100 i 320 ug białka plus BCG, uzyskując wyniki potwierdzające immunogenność szczepionki ałun-ALM+BCG. Zatem ALM wytrącony ałunem zmieszany z 1/10 BCG wydaje się stanowić bezpieczną szczepionkę i odpowiedniego kandydata do dalszego rozwoju.

Leiszmanizacja (LZ):

Zaszczepianie żywym zjadliwym Leishmania w celu wytworzenia zmiany w celu zapobieżenia naturalnej infekcji – która zwykle skutkuje licznymi zmianami na odsłoniętych częściach ciała – jest znane jako leiszmanizacja (LZ). Ogólnie rzecz biorąc, wyzdrowienie z CL prowadzi do ochrony przed przyszłymi infekcjami (14). W ciągu ostatnich czterdziestu lat promastigoty L. major hodowane w kulturach bezkomórkowych były wykorzystywane do leiszmanizacji w Izraelu (15) i Iranie (16), a także w populacji wysokiego ryzyka w Uzbekistanie (17). Masowe LZ wykonano na około dwóch milionach ludzi w Iranie jako środek zapobiegawczy podczas wojny irańsko-irackiej w latach 80-tych (16). Jednak praktyka ta została przerwana po wojnie ze względu na sporadyczne długotrwałe uszkodzenia i trudności w standaryzacji produkcji w warunkach bezpośrednio powojennych.

LZ jako żywe wyzwanie w badaniach skuteczności kandydujących szczepionek przeciw leiszmaniozie przyniosłoby znaczne oszczędności czasu i kosztów poprzez radykalne skrócenie czasu obserwacji, wymagań logistycznych i wymaganej wielkości próbki (tym samym narażając mniejszą liczbę uczestników na potencjalne ryzyko związane z nową kandydującą szczepionką). Badania prowokacyjne z LZ zapewniłyby również możliwość pełnego zbadania odpowiedzi immunologicznych, ponieważ wielkość próby jest znacznie mniejsza niż w badaniach skuteczności polowej; stąd można szukać korelatów ochrony, które można by wykorzystać w późniejszej ocenie i selekcji szczepionek. Chociaż wiele wiadomo na temat mechanizmów odpornościowych w eksperymentalnej leiszmaniozie, na dzień dzisiejszy nie ustalono zastępczych markerów odporności ochronnej u ludzi. Wyszukiwanie takich markerów w terenowych próbach skuteczności jest bardzo trudne i kosztowne, zwłaszcza jeśli dzieci są docelową populacją ryzyka.

Ponadto LZ jako żywa prowokacja w badaniach skuteczności potencjalnej szczepionki przeprowadzonych w ogniskach endemicznych służyłaby dwóm celom: a) ocenie skuteczności ochronnej potencjalnej szczepionki oraz b) ochronie biorców przed naturalnie występującym CL, zwykle mnogimi zmianami na twarzy lub inne odsłonięte części ciała. W związku z tym wszyscy uczestnicy będą chronieni albo szczepionką kandydującą, albo LZ.

Wstępne badania bezpieczeństwa i immunogenności LZ:

We wstępnych badaniach jako pierwszy krok w celu opracowania powtarzalnego systemu prowokacji do oceny różnych kandydatów na szczepionki przeciwko leiszmaniozie przed (lub prawdopodobnie zamiast) próbami terenowymi skuteczności na dużą skalę, w Razi Institute wyprodukowano zamrożone żywe Leishmania major (5 x 105 promastigotów na inokulację ) do stosowania jako żywe inokulum do prowokacji (19). W badaniu klinicznym mającym na celu zbadanie bezpieczeństwa i immunogenności LZ oraz rozwoju zmian chorobowych wynikających ze sztucznej infekcji, wybrano 23 dorosłych ochotników płci męskiej z Iranu i poddano ich leiszmanizacji (19). Ewolucję zmian chorobowych u wszystkich ochotników sprawdzano i rejestrowano dwa razy w miesiącu, a podczas każdej wizyty kontrolnej wykonywano zdjęcie, aż do całkowitego wygojenia. Osiemdziesiąt trzy procent (19/23) ochotników rozwinęło zmiany po LZ (17/23 w ciągu 60 dni LZ). Największy rozmiar owrzodzenia wynosił 17,5 mm. Najdłuższy okres gojenia wyniósł 285 dni (u jednego ochotnika). Nie zaobserwowano ani nie zgłoszono żadnych poważnych działań niepożądanych związanych z LZ, wymagających pomocy medycznej. W drugiej próbie LZ zastosowano u 20 ochotników, w tym 14 osób z pierwszej próby (11 miało wcześniej rozwiniętą zmianę, a 3 nie). Wyniki wykazały podobieństwo między żywą prowokacją a naturalną infekcją. Rzeczywiście, ochotnicy, u których rozwinęła się zmiana chorobowa po pierwszym LZ i jeden wyleczony przypadek z naturalnej infekcji, byli całkowicie odporni i nie rozwinęli nowej zmiany chorobowej po prowokacji na żywo. Wszyscy ochotnicy bez historii CL i ci, u których nie rozwinęły się zmiany w poprzednim badaniu, nie byli odporni i rozwinęła się zmiana. Przebieg rozwoju zmian był podobny do obserwowanego podczas pierwszej próby LZ. Potwierdza to, że LZ można skutecznie i powtarzalnie stosować jako narzędzie do oceny ochrony indukowanej przez kandydującą szczepionkę. Ponadto LZ nadaje odporność na ponowne zakażenie, jeśli kandydat na szczepionkę tego nie zrobi (19). Po tych badaniach przeprowadzono sponsorowane przez TDR, randomizowane, kontrolowane badanie z pojedynczą ślepą próbą, oznaczone jako LZ3, w celu oceny bezpieczeństwa, immunogenności i skuteczności czterech różnych dawek ałunu-ALM (10 100, 200 i 320 ug ALM) plus 1/ 10 BCG przeciwko CL spowodowanej leiszmanizacją. Docelowa wielkość próby (N = 30 w każdym ramieniu) została obliczona zgodnie z 80% mocą przy poziomie ufności 0,05, 50% ochrona przed LZ, 60% częstość przyjmowania LZ w grupie kontrolnej placebo (częstość przyjmowania = rozwój zmian chorobowych z owrzodzeniem ) i 10% strata w następstwie. Założenia te opierały się na wynikach dwóch wcześniejszych prób leiszmanizacji (oznaczonych jako LZ1 i LZ2) na zdrowych ochotnikach przy użyciu tego samego żywego pasożyta (stabilatu), który został wyprodukowany w 1997 r., wystandaryzowany i przechowywany w stanie zamrożonym w płynnym N2 do momentu użycia. Proces został wszczęty w 2001 roku ze znacznym opóźnieniem. Czas oceny skuteczności ustalono na 135 i 184 dzień (75 i 124 dzień po prowokacji żywym organizmem) na podstawie dwóch poprzednich badań LZ z użyciem tego samego stabilizatora. Jednak ze względu na niedostatek aktywnego rozwoju zmian, protokół został zmieniony, aby ocenić wynik w późniejszym terminie. Ta próba napotkała poważne trudności. Co najważniejsze, problemy z wirulencją żywej prowokacji, które prowadzą do znacznie niższego niż oczekiwano wskaźnika pobrania (około 45% zamiast oczekiwanych 80-100%), sprawiły, że zdecydowana wielkość próby była niewystarczająca do oceny skuteczności szczepionki. Jednak pomimo niejednoznacznych wyników skuteczności, ta próba wyraźnie wykazała bezpieczeństwo różnych dawek ałunu-ALM + BCG. Aby właściwie ocenić skuteczność tej kandydującej szczepionki, postanowiono powtórzyć próbę.

Ryzyka i potencjalne korzyści:

Jak zaobserwowano w poprzednich badaniach w Sudanie i Iranie, ryzyko związane z pojedynczym wstrzyknięciem ałunu-ALM + BCG ogranicza się do lokalnych reakcji, od stwardnienia do owrzodzenia. Zmiany te są spowodowane wstrzyknięciem BCG stosowanym jako adiuwant i mają tendencję do gojenia się w ciągu 30-40 dni. Podobnie zagrożenia związane z LZ, obserwowane w LZ1, LZ2 i LZ3, to zmiany miejscowe, które goją się samoistnie, pozostawiając zwykle bliznę. Jak wspomniano wcześniej, LZ jako metoda ochrony jest poszukiwana przez mieszkańców obszarów endemicznych, którzy w przeciwnym razie byliby narażeni na bardzo duże ryzyko naturalnej infekcji i wynikających z niej mnogich zmian na twarzy, dłoniach lub innych odsłoniętych częściach ciała. W tym badaniu klinicznym LZ prowadziłoby do ochrony u osób, które nie byłyby odporne w wyniku wstrzyknięcia szczepionki kandydującej.

Uzasadnienie przeprowadzenia badania Badanie kliniczne przedstawione w niniejszym protokole ma na celu ocenę bezpieczeństwa, immunogenności i skuteczności pojedynczej i podwójnej śródskórnej iniekcji 200 μg autoklawowanej strąconej ałunem szczepionki L. major (Alum-ALM) plus BCG zdrowym irańskim ochotnikom , przy wysokim ryzyku CL z powodu L. major, po której następuje leiszmanizacja. Grupa porównawcza otrzyma sól fizjologiczną zamiast kandydującej szczepionki i ta grupa określi wskaźnik przyjmowania żywej prowokacji. Inna grupa porównawcza otrzyma BCG metodą podwójnie ślepej próby.

Cele i cel badania Główne cele Dalsza ocena bezpieczeństwa pojedynczych i podwójnych wstrzyknięć ałunu-ALM (200 μg białka Leishmania) zmieszanego z 1/10 dawki szczepionki BCG w ciągu 30 dni po wstrzyknięciu dawki przypominającej u ochotników z Iranu, a następnie wyzwanie na żywo z L.-dur w celu oceny ochrony.

Określenie ochrony indukowanej przed prowokacją żywą przez podwójne wstrzyknięcie ałunu-ALM zmieszanego z BCG 30 dni po ostatnim szczepieniu.

Aby określić, czy wstrzyknięcie przypominające Alum-ALM + BCG indukuje silniejsze odpowiedzi immunologiczne mierzone testem skórnym.

Ochrona jest zdefiniowana jako brak rozwoju zmian wrzodziejących (zgodnie z CL) w dniach 180 + 15 po leiszmanizacji w miejscu LZ.

Pierwszorzędowe punkty końcowe Występowanie miejscowych i/lub ogólnoustrojowych zdarzeń niepożądanych (AE) w ciągu 30 dni po szczepieniu oceniane na podstawie wywiadu, badania przedmiotowego.

Odsetek ochotników chronionych przed CL (brak zmiany chorobowej) w porównaniu z grupą kontrolną w dniu 180 + 15 po LZ.

Schematy dawkowania Kohorta 1. Podwójne wstrzyknięcia (w odstępie 30 dni) Alum-ALM 200 μg zmieszane z 1/10 normalnej dawki BCG (n = 50).

Kohorta 2. Podwójne wstrzyknięcia (w odstępie 30 dni) 1/10 normalnej dawki BCG (n = 50).

Kohorta 3. Podwójne wstrzyknięcia komparatora (= sam rozcieńczalnik BCG) jako kontrola (n = 50) Oczekuje się, że wszystkie zmiany wywołane szczepieniem zostaną wyleczone przed 60 dniem (dzień LZ). Wszyscy kwalifikujący się ochotnicy otrzymają LZ z tym samym stabilizatorem w dniu 60. Ochotnicy będą monitorowani przez co najmniej 240 dni lub do całkowitego wyleczenia zmian wywołanych leiszmanizacją).