Os efeitos do GLA em voluntários humanos

As vacinas contra doenças infecciosas têm sido fundamentais para a melhoria da saúde humana e continuam a ser um pilar das estratégias modernas de saúde pública. No entanto, infecções graves que ameaçam a vida, incluindo HIV, malária e tuberculose, continuam sendo um problema global e doenças pandêmicas como a gripe continuam a ameaçar a vida humana. Além disso, as vacinas estão sendo buscadas nas áreas de prevenção e tratamento do câncer. Uma barreira fundamental que impediu vacinas eficazes para muitas doenças é que as vacinas convencionais baseadas em proteínas não provocam o requisito crítico de imunidade mediada por células T. Uma abordagem para gerar uma resposta melhorada de células T a uma vacina tem sido identificar novos candidatos a alvos de proteínas. Esta abordagem não resultou em avanços significativos no desenvolvimento de vacinas. Estamos interessados ​​em uma nova abordagem que combina estimulantes imunológicos específicos, ou adjuvantes, com um alvo de vacina para otimizar e aumentar a resposta imune de células T desejada. O desenvolvimento e estudo de novos adjuvantes como o GLA nos permitirá aprofundar nossa investigação sobre vacinas direcionadas para células dendríticas, levando a vacinas aprimoradas para muitas doenças diversas.

Toll-Like Receptor (TLR) Histórico Os TLRs são receptores transmembrana tipo 1 que compartilham um domínio de repetição rico em leucina (LRR) no loop extracelular e um domínio de homologia do receptor Toll/IL-1 (TIR) ​​na cauda intracelular. A importância dos TLRs para a defesa e imunidade do hospedeiro foi apreciada pela primeira vez em Drosophila, que se tornou suscetível a infecções fúngicas após a deleção genética dos genes toll. Homólogos de mamíferos foram identificados logo após o uso de uma cepa de camundongos que era bem conhecida por ser altamente suscetível a infecções Gram-negativas e hiporresponsivas a lipopolissacarídeos (LPS). Descobriu-se que esses camundongos tinham uma alteração mutacional no gene TLR4, tornando-o não funcional e essa descoberta solidificou a existência e a importância das proteínas Toll em mamíferos. Camundongos com deleções genéticas de TLR4 demonstraram a importância de TLR para infecções bacterianas e forneceram evidências claras de que TLR4 era específico para infecções Gram negativas. Atualmente, 10 TLRs funcionais foram descobertos em humanos e uma extensa pesquisa identificou vários agonistas derivados de patógenos para TLRs específicos. É geralmente aceito que os TLRs funcionam reconhecendo estruturas conservadas de um organismo ou padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Claramente, esses receptores inatos são essenciais para sobreviver a um insulto microbiano, pois fornecem uma primeira linha de defesa que não depende da geração de uma resposta específica de células T e células B, um processo que pode levar semanas. Apesar de seu claro papel na imunidade inata, há evidências crescentes de que a estimulação de TLR tem uma influência potente no desenvolvimento da imunidade mediada por células T e B por meio da ativação e maturação de células dendríticas (DC). Esse conhecimento levou ao desenvolvimento de adjuvantes de vacina baseados em TLR que ativam e amadurecem DC.

Visão geral das células dendríticas e monócitos As células dendríticas (DC) fazem parte dos sistemas imunológico inato e adaptativo e residem nas interfaces hospedeiro-microbiana, incluindo as superfícies do intestino, pulmão e dentro da pele. Essas células constantemente pesquisam seu ambiente em busca de patógenos microbianos através da expressão de várias famílias de receptores de reconhecimento de padrão (PRR), incluindo os receptores Toll-like (TLR). As DC imaturas são particularmente eficientes na captação e processamento de antígenos, enquanto as DC ativadas amadurecem e se tornam potentes células apresentadoras de antígenos para os linfócitos T. É importante ressaltar que as DC imaturas têm o potencial de induzir tolerância imunológica ao deletar as células T específicas do antígeno, resultando em nenhuma resposta imune. As DC ativadas, no entanto, direcionam a resposta imune através da liberação de citocinas específicas. Diferentes estímulos iniciais influenciarão DC para conduzir células T CD4+ para se diferenciar ao longo de vias funcionais muito divergentes, incluindo Th1, Th2, Th17 e Treg. Portanto, as DC são críticas para a defesa inata do hospedeiro, bem como para orquestrar uma resposta adaptativa. Dado seu papel fundamental na defesa do hospedeiro, as DC são células relativamente raras que, em estado estacionário, se desenvolvem independentemente de outras células sanguíneas. Aprimorar e direcionar a função e a quantidade de DC trará benefícios tanto para as defesas do hospedeiro quanto para a ciência da vacina. O laboratório Steinman foi pioneiro em um novo método de vacinação ao direcionar o antígeno de interesse especificamente para a população DC. Vacinas direcionadas a DC mostraram-se promissoras em modelos animais e uma vacina contra HIV direcionada a DC foi recentemente administrada a humanos pela primeira vez.

Os monócitos são um tipo de célula mais abundante que representa aproximadamente 10% dos leucócitos do sangue em humanos e 4% em camundongos. Os monócitos são células efetoras do sangue periférico que participam da defesa do hospedeiro e são células de eliminação eficientes. Eles servem como precursores de macrófagos teciduais. Em humanos, 3 subconjuntos de monócitos foram propostos com base na expressão da superfície celular de CD14 e CD16, enquanto 2 subconjuntos existem em camundongos e são marcados por CD115 e Ly6C. O papel desses subconjuntos durante a imunidade inata requer uma investigação mais aprofundada. Evidências sugerem que os monócitos podem ser induzidos a se diferenciar em DC, no entanto, evidências in vivo definitivas disso não existiam anteriormente. Trabalhos recentes no laboratório Steinman mostraram que as DC autênticas in vivo podem ser rapidamente diferenciadas e mobilizadas do maior pool de monócitos em tempos de inflamação aguda e infecção. Essa rápida redistribuição poderia ser induzida por bactérias gram-negativas ou LPS e era totalmente dependente de TLR4. Da mesma forma, os monócitos humanos podem ser induzidos a se diferenciar em DC, no entanto, a compreensão desse processo é limitada à cultura celular in vitro com grandes lacunas em nossa compreensão das DC derivadas de monócitos humanos in vivo. Dados preliminares sugerem que a administração de GLA em camundongos, como LPS, pode mobilizar o pool de monócitos para se tornar Mo-DC. Não se sabe se os monócitos humanos in vivo expandem rapidamente a população de DC após a administração do adjuvante TLR4 GLA. A compreensão dos mecanismos dessa reimplantação aumentará nossa compreensão de como expandir e aproveitar rapidamente a utilidade do DC usando adjuvantes. Por fim, prevemos que as respostas de DC específicas do adjuvante melhorarão a imunidade das células T e aumentarão a eficácia da vacina.

Justificativa para a investigação de um adjuvante em isolamento O teste padrão de adjuvante consiste no adjuvante sob investigação combinado com uma vacina licenciada conhecida, mas não isoladamente. No entanto, conforme descrito anteriormente, esperamos que o GLA possa se tornar um importante adjuvante de nossa vacina contra o HIV direcionada a DC atualmente em desenvolvimento. A DC representa a célula apresentadora de antígeno mais potente e direcionar especificamente um antígeno de interesse para esta célula gera respostas imunes melhoradas. No entanto, há considerações importantes ao direcionar o antígeno para DC. DC imaturas não estimuladas que encontram um antígeno têm a capacidade de deletar células T específicas do antígeno, causando tolerância, e uma vacina de antígeno direcionada a DC sozinha pode causar tolerância imunológica. Em contraste, as DC que amadureceram são capazes de induzir respostas potentes de células T efetoras ao antígeno alvo. DC pode ser ativado por estimulação de TLR e, portanto, combinar a maturação de DC estimulada por TLR com um antígeno direcionado a DC resultaria em imunidade mediada por células T ideal. Em teoria, a vacina direcionada a DC nunca poderia ser administrada sem um adjuvante de amadurecimento de DC e os efeitos e ações específicos do GLA não seriam conhecidos, a menos que fossem estudados primeiro isoladamente. Para planejar um eventual teste de vacina contra o HIV direcionado a DC com um adjuvante, também será crítico conhecer os efeitos imunológicos temporais do GLA isolado.

Informações básicas do GLA O GLA é uma nova molécula completamente sintética de lipídeo A (componente ativo do LPS natural) que combina 6 cadeias de acil com um único local de fosforilação. A vantagem desta molécula tipo LPS é que ela não é purificada a partir de uma fonte bacteriana, permitindo assim uma solução homogênea contendo apenas moléculas com 6 cadeias de acil. Isso é importante porque 6 cadeias de acil resulta em ativação máxima de TLR4, enquanto as moléculas de lipídio A com 5 ou 7 cadeias de acil são 100 vezes menos ativas e 4 cadeias de acil são imunoinibitórias. MPL é um adjuvante de vacina TLR4 existente que é derivado de salmonela LPS e representa uma mistura heterogênea de 3, 4, 5 e 6 moléculas aciladas. MPL induz uma resposta eficaz de anticorpos humorais durante a vacinação, mas não gera imunidade de células T CD4, tornando-se um adjuvante indesejável para muitas vacinas baseadas em proteínas. Em modelos animais, o GLA adicionado à vacina Fluzone melhora a imunidade humoral e celular contra influenza. O GLA foi testado em seres humanos quanto à segurança em combinação com uma vacina contra influenza, no entanto, seus efeitos individuais não foram estudados. Particularmente, os efeitos isolados na regulação de citocinas, quimiocinas e genes em humanos não são conhecidos e os subconjuntos de monócitos não foram previamente investigados.

A formulação ideal e a via de administração não são conhecidas; portanto, um componente importante desta investigação será determinar uma formulação e via segura e tolerável. O GLA foi administrado a humanos em combinação com a vacina Fluzone variando em doses de 0,5 μg a 5 μg por via intramuscular; porém não foi testado isoladamente, sendo utilizada apenas a emulsão óleo-em-água estável (GLA-SE). Fluzone é uma vacina reatogênica e toxicidade limitante da dose ocorreu em 3 de 4 pacientes que receberam Fluzone + alta dose de GLA-SE (5μg), mas um bom perfil de segurança foi observado entre 0,5-2,5μg. A emulsão estável (SE) contém esqualeno e foi utilizada a 2% (vol:vol). Continuaremos a usar esse percentual em nossa formulação GLA-SE. Uma segunda formulação de GLA foi subsequentemente desenvolvida para evitar a necessidade de uma emulsão; O GLA-AF é aquoso e teoricamente deveria ter um perfil de efeitos colaterais reduzido e menos reatogenicidade do que o GLA-SE. Planejamos comparar as duas formulações de GLA isoladamente; GLA-SE (emulsão estável) e GLA-AF (formulação aquosa). O GLA-AF nunca foi administrado a humanos e, portanto, esta versão representa o primeiro teste em humanos. Por questões de segurança, as injeções de GLA-AF devem ser separadas por um dia e, como não será possível saber quem receberá GLA-AF, injetaremos os primeiros nove indivíduos em cada coorte com um dia de intervalo. Devido à complexidade do número de grupos neste estudo, vamos inscrever e completar cada rota sequencialmente como uma coorte. A coorte subcutânea será o primeiro grupo triado, inscrito, randomizado e injetado, seguido por intramuscular.

Resumo Este estudo será um ensaio clínico de fase 1, randomizado, controlado por placebo e duplo-cego para comparar a formulação de GLA e a via de administração em humanos. A segurança e tolerabilidade das diferentes formulações (GLA-SE vs. GLA-AF) e vias (SC, IM, ID) serão o foco principal. Nosso segundo foco será detalhar a resposta imune global medindo citocinas sistêmicas, quimiocinas e regulação global de genes. O terceiro foco será investigar os efeitos do GLA nas células imunes do sangue periférico, incluindo monócitos e células dendríticas. Este estudo adicionará os primeiros dados humanos sobre o GLA-AF e detalhará os efeitos isolados do GLA no sistema imunológico inato. Os resultados deste teste estabelecerão as bases para um verdadeiro teste de adjuvante usando antígeno GLA + e, finalmente, para usar GLA como adjuvante de nossa vacina direcionada a DC em humanos.