Wpływ GLA na ochotników

Szczepionki przeciwko chorobom zakaźnym odegrały kluczową rolę w poprawie zdrowia ludzi i pozostają filarem nowoczesnych strategii zdrowia publicznego. Jednak poważne, zagrażające życiu infekcje, w tym HIV, malaria i gruźlica, pozostają problemem globalnym, a choroby pandemiczne, takie jak grypa, nadal zagrażają ludzkiemu życiu. Obecnie trwają również prace nad szczepionkami w dziedzinie profilaktyki i leczenia raka. Podstawową barierą, która uniemożliwiła skuteczne szczepionki przeciwko wielu chorobom, jest to, że konwencjonalne szczepionki oparte na białkach nie wywołują krytycznego wymogu odporności za pośrednictwem komórek T. Jednym ze sposobów generowania ulepszonej odpowiedzi komórek T na szczepionkę jest identyfikacja nowych kandydatów na docelowe białka. Takie podejście nie przyniosło znaczących postępów w opracowywaniu szczepionek. Jesteśmy zainteresowani nowatorskim podejściem, które łączy specyficzne immunostymulanty lub adiuwanty z celem szczepionki w celu optymalizacji i wzmocnienia pożądanej odpowiedzi immunologicznej komórek T. Rozwój i badanie nowych adiuwantów, takich jak GLA, pozwoli nam kontynuować badania nad szczepionkami ukierunkowanymi na komórki dendrytyczne, prowadząc do ulepszonych szczepionek przeciwko wielu różnym chorobom.

Tło receptora Toll-podobnego (TLR) TLR to transbłonowe receptory typu 1, które mają wspólną domenę powtórzeń bogatą w leucynę (LRR) w pętli zewnątrzkomórkowej i domenę homologii receptora Toll/IL-1 (TIR) ​​w ogonie wewnątrzkomórkowym. Znaczenie TLR dla obrony i odporności gospodarza zostało po raz pierwszy docenione u Drosophila, która stała się podatna na infekcje grzybicze po genetycznej delecji genów opłat. Homologi ssaków zidentyfikowano wkrótce po zastosowaniu szczepu myszy, o którym dobrze wiadomo, że jest wysoce podatny na infekcje Gram-ujemne i słabo reaguje na lipopolisacharyd (LPS). Stwierdzono, że te myszy mają zmianę mutacyjną w genie TLR4, czyniąc go niefunkcjonalnym, a to odkrycie ugruntowało istnienie i znaczenie białek Toll u ssaków. Myszy z genetycznymi delecjami TLR4 wykazały znaczenie TLR w infekcjach bakteryjnych i dostarczyły jasnych dowodów na to, że TLR4 jest specyficzny dla infekcji Gram-ujemnych. Obecnie u ludzi odkryto 10 funkcjonalnych receptorów TLR, a szeroko zakrojone badania pozwoliły zidentyfikować wielu agonistów określonych receptorów TLR pochodzących od patogenów. Ogólnie przyjmuje się, że funkcja TLR polega na rozpoznawaniu konserwatywnych struktur organizmu lub wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP). Oczywiście te wrodzone receptory mają kluczowe znaczenie dla przetrwania ataku drobnoustrojów, ponieważ zapewniają pierwszą linię obrony, która nie jest zależna od generowania specyficznej odpowiedzi komórek T i B, co może zająć tygodnie. Pomimo ich wyraźnej roli we wrodzonej odporności, gromadzą się dowody na to, że stymulacja TLR ma silny wpływ na rozwój odporności, w której pośredniczą limfocyty T i B, poprzez aktywację i dojrzewanie komórek dendrytycznych (DC). Wiedza ta doprowadziła do opracowania adiuwantów szczepionek opartych na TLR, które aktywują i dojrzewają DC.

Przegląd monocytów i komórek dendrytycznych Komórki dendrytyczne (DC) są częścią wrodzonego i nabytego układu odpornościowego i znajdują się na powierzchniach styku między gospodarzem a drobnoustrojami, w tym na powierzchni jelit, płuc iw skórze. Komórki te stale badają swoje środowisko w poszukiwaniu patogenów drobnoustrojowych poprzez ekspresję kilku rodzin receptorów rozpoznawania wzorców (PRR), w tym receptorów Toll-podobnych (TLR). Niedojrzałe DC są szczególnie skuteczne w wychwytywaniu i przetwarzaniu antygenu, podczas gdy aktywowane DC dojrzewają i stają się silnymi komórkami prezentującymi antygen limfocytom T. Co ważne, niedojrzałe DC mają potencjał indukowania tolerancji immunologicznej poprzez usuwanie komórek T specyficznych dla antygenu, co skutkuje brakiem odpowiedzi immunologicznej. Aktywowane DC kierują jednak odpowiedzią immunologiczną poprzez uwalnianie określonych cytokin. Różne początkowe bodźce będą wpływać na DC, aby napędzać limfocyty T CD4+ do różnicowania wzdłuż bardzo rozbieżnych szlaków funkcjonalnych, w tym Th1, Th2, Th17 i Treg. Dlatego DC mają kluczowe znaczenie dla odpowiedniej wrodzonej obrony gospodarza, a także dla orkiestracji odpowiedzi adaptacyjnej. Biorąc pod uwagę ich kluczową rolę w obronie gospodarza, DC są stosunkowo rzadkimi komórkami, które w stanie ustalonym rozwijają się niezależnie od innych komórek krwi. Wzmocnienie i ukierunkowanie funkcji i ilości DC przyniesie korzyści zarówno obronie gospodarza, jak i nauce o szczepionkach. Laboratorium Steinmana jest pionierem w nowatorskiej metodzie szczepienia poprzez ukierunkowanie antygenu będącego przedmiotem zainteresowania konkretnie na populację DC. Szczepionki ukierunkowane na DC okazały się obiecujące w modelach zwierzęcych, a szczepionka przeciwko HIV ukierunkowana na DC została niedawno podana ludziom po raz pierwszy.

Monocyty są bardziej rozpowszechnionym rodzajem komórek, które stanowią około 10% leukocytów krwi u ludzi i 4% u myszy. Monocyty to komórki efektorowe krwi obwodowej, które uczestniczą w obronie gospodarza i są wydajnymi komórkami wychwytującymi. Służą jako prekursory makrofagów tkankowych. U ludzi zaproponowano 3 podzbiory monocytów w oparciu o ekspresję CD14 i CD16 na powierzchni komórki, podczas gdy u myszy istnieją 2 podzbiory, które są oznaczone przez CD115 i Ly6C. Rola tych podzbiorów podczas odporności wrodzonej wymaga dalszych badań. Dowody sugerują, że monocyty można indukować do różnicowania się w DC, jednak wcześniej brakowało na to ostatecznych dowodów in vivo. Niedawne prace w laboratorium Steinmana wykazały, że autentyczne DC in vivo można szybko różnicować i mobilizować z większej puli monocytów w okresach ostrego stanu zapalnego i infekcji. To szybkie ponowne rozmieszczenie mogło być wywołane przez bakterie Gram-ujemne lub LPS i było całkowicie zależne od TLR4. Podobnie, ludzkie monocyty mogą być deindukowane do różnicowania się w DC, jednak zrozumienie tego procesu jest ograniczone do hodowli komórkowej in vitro z dużymi lukami w naszym zrozumieniu DC pochodzącego z ludzkich monocytów in vivo. Wstępne dane sugerują, że podawanie GLA myszom, podobnie jak LPS, może zmobilizować pulę monocytów do przekształcenia się w Mo-DC. Nie wiadomo, czy ludzkie monocyty in vivo szybko powiększają populację DC po podaniu adiuwantu TLR4 GLA. Zrozumienie mechanizmów tego ponownego rozmieszczenia pozwoli nam lepiej zrozumieć, jak szybko rozszerzyć i wykorzystać użyteczność DC za pomocą adiuwantów. Ostatecznie przewidujemy, że odpowiedzi DC specyficzne dla adiuwantu poprawią odporność komórek T i zwiększą skuteczność szczepionki.

Uzasadnienie badania adiuwanta w izolacji Standardowa próba adiuwanta składa się z badanego adiuwanta połączonego ze znaną licencjonowaną szczepionką, ale nie w izolacji. Jednak, jak opisano wcześniej, mamy nadzieję, że GLA może stać się ważnym adiuwantem naszej obecnie opracowywanej szczepionki przeciwko HIV ukierunkowanej na DC. DC reprezentuje najsilniejszą komórkę prezentującą antygen, a specyficzne ukierunkowanie antygenu będącego przedmiotem zainteresowania na tę komórkę generuje ulepszone odpowiedzi immunologiczne. Jednak przy kierowaniu antygenu na DC należy wziąć pod uwagę ważne kwestie. Niedojrzałe niestymulowane DC, które napotkają antygen, mają zdolność usuwania komórek T specyficznych dla antygenu, powodując w ten sposób tolerancję, a sama szczepionka antygenowa ukierunkowana na DC może powodować tolerancję immunologiczną. W przeciwieństwie do DC, które dojrzały, są zdolne do indukowania silnych odpowiedzi efektorowych komórek T na docelowy antygen. DC można aktywować przez stymulację TLR, a zatem połączenie dojrzewania DC stymulowanego TLR z antygenem ukierunkowanym na DC skutkowałoby optymalną odpornością, w której pośredniczą limfocyty T. Teoretycznie szczepionka ukierunkowana na DC nigdy nie mogłaby być podana bez adiuwanta dojrzewającego DC, a specyficzne efekty i działanie GLA nie byłyby znane, gdyby nie zbadano go najpierw w izolacji. Aby zaplanować ewentualną próbę szczepionki przeciwko HIV ukierunkowanej na DC z adiuwantem, kluczowa będzie również znajomość czasowych skutków immunologicznych wyizolowanego GLA.

Informacje ogólne o GLA GLA to nowa, całkowicie syntetyczna cząsteczka lipidu A (aktywny składnik naturalnego LPS), która łączy 6 łańcuchów acylowych z pojedynczym miejscem fosforylacji. Zaletą tej podobnej do LPS cząsteczki jest to, że nie jest ona oczyszczana ze źródła bakteryjnego, co umożliwia otrzymanie jednorodnego roztworu zawierającego tylko cząsteczki z 6 łańcuchami acylowymi. Jest to ważne, ponieważ 6 łańcuchów acylowych powoduje maksymalną aktywację TLR4, podczas gdy cząsteczki lipidu A z 5 lub 7 łańcuchami acylowymi są 100 razy mniej aktywne, a 4 łańcuchy acylowe mają działanie immunohamujące. MPL jest istniejącym adiuwantem szczepionki TLR4, który pochodzi z LPS salmonelli i stanowi heterogenną mieszaninę 3, 4, 5 i 6 acylowanych cząsteczek. MPL indukuje skuteczną humoralną odpowiedź przeciwciał podczas szczepienia, ale nie generuje odporności komórek T CD4, co czyni go niepożądanym adiuwantem dla wielu szczepionek opartych na białkach. W modelach zwierzęcych GLA dodany do szczepionki Fluzone poprawia humoralną i komórkową odporność na grypę. GLA został przetestowany na ludziach pod kątem bezpieczeństwa w połączeniu ze szczepionką przeciw grypie, jednak jego indywidualne skutki nie zostały zbadane. W szczególności nie jest znany izolowany wpływ na regulację cytokin, chemokin i genów u ludzi, a podzbiory monocytów nie były wcześniej badane.

Optymalna postać i droga podania nie są znane; dlatego głównym elementem tego badania będzie określenie bezpiecznej i tolerowanej postaci i drogi podania. GLA podawano ludziom w połączeniu ze szczepionką Fluzone w dawkach od 0,5 μg do 5 μg domięśniowo; jednak nie był testowany w izolacji i zastosowano tylko stabilną emulsję typu olej w wodzie (GLA-SE). Fluzone jest szczepionką reaktogenną i toksyczność ograniczająca dawkę wystąpiła u 3 z 4 pacjentów, którzy otrzymali Fluzone + wysoką dawkę GLA-SE (5 μg), ale zaobserwowano dobry profil bezpieczeństwa w zakresie 0,5-2,5 μg. Stabilna emulsja (SE) zawiera skwalen i została użyta w stężeniu 2% (obj.:obj.). Będziemy nadal używać tej wartości procentowej w naszym preparacie GLA-SE. Następnie opracowano drugi preparat GLA, aby uniknąć konieczności stosowania emulsji; GLA-AF jest wodny i teoretycznie powinien mieć zmniejszony profil skutków ubocznych i mniejszą reaktogenność niż GLA-SE. Planujemy porównać dwa preparaty GLA w izolacji; GLA-SE (stabilna emulsja) i GLA-AF (preparat wodny). GLA-AF nigdy nie był podawany ludziom i dlatego ta wersja stanowi pierwsze badanie na ludziach. Ze względów bezpieczeństwa zastrzyki z GLA-AF muszą być rozdzielone o jeden dzień, a ponieważ nie będzie można wiedzieć, kto otrzyma GLA-AF, wstrzykniemy pierwszych dziewięciu pacjentom z każdej kohorty w odstępie jednego dnia. Ze względu na złożoność liczby grup w tym badaniu będziemy rejestrować i ukończyć każdą trasę sekwencyjnie jako kohorta. Kohorta podskórna będzie pierwszą grupą poddaną badaniu przesiewowemu, włączeniu, randomizacji i wstrzyknięciu, a następnie domięśniowo.

Podsumowanie To badanie będzie pierwszą fazą, randomizowanym, kontrolowanym placebo, podwójnie zaślepionym badaniem klinicznym mającym na celu porównanie preparatu GLA i drogi podawania u ludzi. Głównym celem będzie bezpieczeństwo i tolerancja różnych preparatów (GLA-SE vs. GLA-AF) i dróg (SC, IM, ID). Naszym drugim celem będzie uszczegółowienie globalnej odpowiedzi immunologicznej poprzez pomiar ogólnoustrojowych cytokin, chemokin i globalnej regulacji genów. Trzecim celem będzie zbadanie wpływu GLA na komórki odpornościowe krwi obwodowej, w tym monocyty i komórki dendrytyczne. To badanie doda pierwsze dane dotyczące GLA-AF u ludzi i szczegółowo wyizoluje wpływ GLA na wrodzony układ odpornościowy. Wyniki tego badania położą podwaliny pod prawdziwą próbę adiuwantową z użyciem antygenu GLA + i ostatecznie do zastosowania GLA jako adiuwanta naszej szczepionki ukierunkowanej na DC u ludzi.