Účinky GLA na lidské dobrovolníky

Vakcíny proti infekčním chorobám pomáhají zlepšit lidské zdraví a zůstávají pilířem moderních strategií veřejného zdraví. Přesto závažné život ohrožující infekce včetně HIV, malárie a tuberkulózy zůstávají globálním problémem a pandemická onemocnění, jako je chřipka, nadále ohrožují lidský život. Vakcíny se nyní prosazují také v oblasti prevence a léčby rakoviny. Základní bariérou, která brání účinným vakcínám u mnoha nemocí, je to, že konvenční vakcíny na bázi proteinů nevyvolávají kritický požadavek imunity zprostředkované T-buňkami. Jedním přístupem ke generování zlepšené odpovědi T-buněk na vakcínu byla identifikace nových kandidátů na cílový protein. Tento přístup nevedl k významnému pokroku ve vývoji vakcín. Zajímá nás nový přístup, který kombinuje specifické imunitní stimulanty nebo adjuvancia s cílem vakcíny pro optimalizaci a posílení požadované imunitní reakce T-buněk. Vývoj a studium nových adjuvans, jako je GLA, nám umožní dále zkoumat vakcíny cílené na dendritické buňky, což povede ke zlepšeným vakcínám pro mnoho různých onemocnění.

Pozadí Toll-like receptoru (TLR) TLR jsou transmembránové receptory typu 1, které sdílejí opakující se doménu bohatou na leucin (LRR) v extracelulární smyčce a homologní doménu Toll/IL-1 receptoru (TIR) ​​v intracelulárním ocasu. Význam TLR pro obranu a imunitu hostitele byl poprvé oceněn u Drosophila, která se stala citlivou na plísňové infekce po genetické deleci toll genů. Savčí homology byly identifikovány brzy po použití myšího kmene, o kterém bylo dobře známo, že je vysoce citlivý na gramnegativní infekce a byl hyporesponzivní na lipopolysacharid (LPS). U těchto myší bylo zjištěno, že mají mutační změnu na genu TLR4, což jej činí nefunkčním, a tento objev potvrdil existenci a důležitost Toll proteinů u savců. Myši s genetickými delecemi TLR4 prokázaly důležitost TLR pro bakteriální infekce a poskytly jasný důkaz, že TLR4 byl specifický pro Gram negativní infekce. V současné době bylo u lidí objeveno 10 funkčních TLR a rozsáhlý výzkum identifikoval řadu agonistů odvozených od patogenů pro specifické TLR. Obecně se uznává, že funkce TLR rozpoznáním konzervovaných struktur organismu nebo patogenem asociovaných molekulárních vzorů (PAMP). Je zřejmé, že tyto vrozené receptory jsou rozhodující pro přežití mikrobiálního poškození, protože poskytují první linii obrany, která není závislá na generování specifické odpovědi T-buněk a B-buněk, což je proces, který může trvat týdny. Navzdory jejich jasné roli ve vrozené imunitě se hromadí důkazy, že stimulace TLR má silný vliv na rozvoj imunity zprostředkované T a B buňkami prostřednictvím aktivace a zrání dendritických buněk (DC). Tyto znalosti vedly k vývoji adjuvans vakcín na bázi TLR, které aktivují a vyzrávají DC.

Přehled monocytů a dendritických buněk Dendritické buňky (DC) jsou součástí vrozeného a adaptivního imunitního systému a sídlí na rozhraní hostitel-mikrobiální, včetně povrchů střeva, plic a kůže. Tyto buňky neustále zkoumají své prostředí při hledání mikrobiálních patogenů prostřednictvím exprese několika rodin receptorů rozpoznávajících vzory (PRR), včetně receptorů podobných Toll (TLR). Nezralé DC jsou zvláště účinné při příjmu a zpracování antigenu, zatímco aktivované DC dozrávají a stávají se silnými buňkami prezentujícími antigen pro T-lymfocyty. Důležité je, že nezralé DC mají potenciál indukovat imunitní toleranci delecí antigenně specifických T buněk, což má za následek žádnou imunitní odpověď. Aktivované DC však řídí imunitní odpověď prostřednictvím uvolňování konkrétních cytokinů. Různé počáteční stimuly ovlivní DC, aby poháněly CD4+ T-buňky k diferenciaci podél velmi odlišných funkčních drah včetně Th1, Th2, Th17 a Treg. Proto jsou DC rozhodující pro vhodnou vrozenou obranu hostitele, stejně jako pro organizování adaptivní reakce. Vzhledem ke své klíčové roli v obraně hostitele jsou DC relativně vzácné buňky, které se v ustáleném stavu vyvíjejí nezávisle na jiných krevních buňkách. Zlepšení a řízení funkce a množství DC bude přínosem jak pro obranu hostitele, tak pro vědu o vakcínách. Steinmanova laboratoř byla průkopníkem nového způsobu vakcinace zaměřením na požadovaný antigen specificky na populaci DC. DC-cílené vakcíny se ukázaly jako slibné na zvířecích modelech a DC-cílená HIV vakcína byla nedávno poprvé podána lidem.

Monocyty jsou hojnějším typem buněk, které tvoří přibližně 10 % krevních leukocytů u lidí a 4 % u myší. Monocyty jsou efektorové buňky periferní krve, které se účastní obrany hostitele a jsou účinnými vychytávacími buňkami. Slouží jako prekurzory tkáňových makrofágů. U lidí byly navrženy 3 podskupiny monocytů na základě exprese CD14 a CD16 na buněčném povrchu, zatímco 2 podskupiny existují u myší a jsou označeny CD115 a Ly6C. Role těchto podskupin během vrozené imunity vyžaduje další zkoumání. Důkazy naznačují, že monocyty mohou být indukovány k diferenciaci na DC, nicméně definitivní důkazy in vivo o tom dříve chyběly. Nedávná práce ve Steinmanově laboratoři ukázala, že in vivo autentické DC lze rychle odlišit a mobilizovat z většího množství monocytů v době akutního zánětu a infekce. Toto rychlé opětovné nasazení mohlo být vyvoláno buď gramnegativními bakteriemi nebo LPS a bylo zcela závislé na TLR4. Podobně mohou být lidské monocyty de indukovány k diferenciaci na DC, avšak pochopení tohoto procesu je omezeno na in vitro buněčnou kulturu s velkými mezerami v našem chápání DC odvozených z lidských monocytů in vivo. Předběžná data naznačují, že podávání GLA u myší, jako je LPS, může mobilizovat monocytární pool, aby se stal Mo-DC. Není známo, zda lidské monocyty in vivo rychle rozšiřují populaci DC po podání TLR4 adjuvans GLA. Pochopení mechanismů tohoto přemístění prohloubí naše chápání toho, jak rychle expandovat a využít užitečnost DC pomocí adjuvans. Nakonec předpokládáme, že adjuvantní specifické DC reakce zlepší imunitu T-buněk a zvýší účinnost vakcíny.

Odůvodnění pro zkoumání adjuvans v izolaci Standardní adjuvantní studie se skládá ze zkoumaného adjuvans v kombinaci se známou licencovanou vakcínou, ale ne v izolaci. Nicméně, jak bylo popsáno dříve, doufáme, že GLA se může stát důležitým adjuvans naší DC-cílené HIV vakcíny, která je v současné době ve vývoji. DC představuje nejúčinnější buňku prezentující antigen a specifické zacílení na antigen, který je předmětem zájmu této buňky, vytváří zlepšené imunitní reakce. Při zaměřování antigenu na DC jsou však důležité úvahy. Nezralé nestimulované DC, které se setkají s antigenem, mají schopnost deletovat antigenně specifické T buňky, čímž způsobují toleranci, a samotná antigenní vakcína cílená na DC může způsobit imunitní toleranci. Naproti tomu DC, které dozrály, jsou schopné indukovat silné reakce efektorových T buněk na cílový antigen. DC mohou být aktivovány stimulací TLR, a proto by kombinování zrání DC stimulovaného TLR s antigenem cíleným na DC vedlo k optimální imunitě zprostředkované T buňkami. Teoreticky by DC-cílená vakcína nemohla být nikdy podána bez DC zrajícího adjuvans a specifické účinky a působení GLA by nebyly známy, pokud by nebyla studována nejprve izolovaně. Pro plánování případné DC-cílené studie HIV vakcíny s adjuvans bude také důležité znát dočasné imunitní účinky izolované GLA.

Základní informace GLA GLA je nová zcela syntetická molekula lipidu A (aktivní složka přírodního LPS), která kombinuje 6 acylových řetězců s jediným fosforylačním místem. Výhodou této molekuly podobné LPS je, že není purifikována z bakteriálního zdroje, což umožňuje homogenní roztok obsahující pouze molekuly s 6 acylovými řetězci. To je důležité, protože 6 acylových řetězců vede k maximální aktivaci TLR4, zatímco molekuly lipidu A s 5 nebo 7 acylovými řetězci jsou 100krát méně aktivní a 4 acylové řetězce jsou imunoinhibiční. MPL je existující TLR4 vakcínové adjuvans, které je odvozeno z LPS salmonely a představuje heterogenní směs 3, 4, 5 a 6 acylovaných molekul. MPL indukuje účinnou humorální protilátkovou odpověď během vakcinace, ale nevytváří CD4 T-buněčnou imunitu, což z něj činí nežádoucí adjuvans pro mnoho vakcín na bázi proteinů. U zvířecích modelů GLA přidaná do vakcíny Fluzone zlepšuje humorální a buněčnou imunitu vůči chřipce. GLA byla testována na lidech na bezpečnost v kombinaci s vakcínou proti chřipce, ale její jednotlivé účinky nebyly studovány. Zejména izolované účinky na cytokiny, chemokiny a genovou regulaci u lidí nejsou známy a podskupiny monocytů nebyly dříve zkoumány.

Optimální formulace a způsob podávání nejsou známy; proto hlavní součástí tohoto zkoumání bude stanovení bezpečné a tolerovatelné formulace a cesty. GLA byla podávána lidem v kombinaci s vakcínou Fluzone v dávkách od 0,5 μg do 5 μg intramuskulárně; nebyla však testována izolovaně a byla použita pouze emulze stabilní olej ve vodě (GLA-SE). Fluzone je reaktogenní vakcína a toxicita limitující dávku se objevila u 3 ze 4 pacientů, kteří dostali Fluzone + vysokou dávku GLA-SE (5 μg), ale byl pozorován dobrý bezpečnostní profil mezi 0,5-2,5 μg. Stabilní emulze (SE) obsahuje skvalen a byla použita v množství 2 % (obj.:obj.). Toto procento budeme i nadále používat v naší formulaci GLA-SE. Následně byla vyvinuta druhá formulace GLA, aby se zabránilo potřebě emulze; GLA-AF je vodný a teoreticky by měl mít snížený profil vedlejších účinků a menší reaktogenitu než GLA-SE. Plánujeme porovnat dvě formulace GLA izolovaně; GLA-SE (stabilní emulze) a GLA-AF (vodná formulace). GLA-AF nebyl nikdy podáván lidem, a proto tato verze představuje první studii u lidí. Z bezpečnostních důvodů musí být injekce GLA-AF odděleny jedním dnem, a protože nebude možné vědět, kdo dostane GLA-AF, aplikujeme prvním devíti subjektům v každé kohortě s odstupem jednoho dne. Vzhledem ke složitosti počtu skupin v této studii zapíšeme a absolvujeme každou trasu postupně jako kohortu. Subkutánní kohorta bude první skupinou, která bude vyšetřena, zařazena, randomizována a aplikována injekčně, následovaná intramuskulárně.

Shrnutí Tato studie bude fází 1, randomizovaná, placebem kontrolovaná, dvojitě zaslepená klinická studie pro srovnání formulace GLA a způsobu podávání u lidí. Primárním cílem bude bezpečnost a snášenlivost různých formulací (GLA-SE vs. GLA-AF) a cest (SC, IM, ID). Naším druhým cílem bude podrobně popsat globální imunitní odpověď měřením systémových cytokinů, chemokinů a globální genové regulace. Třetím cílem bude zkoumání účinků GLA na imunitní buňky periferní krve včetně monocytů a dendritických buněk. Tato studie přidá první data u člověka o GLA-AF a podrobně popíše izolované účinky GLA na vrozený imunitní systém. Výsledky této studie položí základ pro skutečnou adjuvantní studii s použitím GLA + antigenu a nakonec pro použití GLA k adjuvans naší DC-cílené vakcíny u lidí.