Gli effetti del GLA sui volontari umani

I vaccini contro le malattie infettive sono stati fondamentali per il miglioramento della salute umana e rimangono un pilastro delle moderne strategie di sanità pubblica. Tuttavia, gravi infezioni potenzialmente letali, tra cui l'HIV, la malaria e la tubercolosi, rimangono un problema globale e malattie pandemiche come l'influenza continuano a minacciare la vita umana. Inoltre, i vaccini vengono ora perseguiti nelle aree della prevenzione e del trattamento del cancro. Una barriera fondamentale che ha impedito vaccini efficaci per molte malattie è che i vaccini convenzionali a base di proteine ​​non suscitano il requisito fondamentale dell'immunità mediata dalle cellule T. Un approccio per generare una migliore risposta delle cellule T a un vaccino è stato quello di identificare nuovi candidati bersaglio proteici. Questo approccio non ha portato a progressi significativi nello sviluppo del vaccino. Siamo interessati a un nuovo approccio che combini specifici stimolanti immunitari, o adiuvanti, con un bersaglio vaccinale per ottimizzare e potenziare la risposta immunitaria delle cellule T desiderata. Lo sviluppo e lo studio di nuovi adiuvanti come il GLA ci consentiranno di approfondire la nostra indagine sui vaccini mirati alle cellule dendritiche che portano a vaccini migliorati per molte malattie diverse.

Background dei recettori Toll-Like (TLR) I TLR sono recettori transmembrana di tipo 1 che condividono un dominio ripetuto ricco di leucina (LRR) nell'ansa extracellulare e un dominio di omologia del recettore Toll/IL-1 (TIR) ​​nella coda intracellulare. L'importanza dei TLR per ospitare la difesa e l'immunità è stata apprezzata per la prima volta nella Drosophila che è diventata suscettibile alle infezioni fungine in seguito alla delezione genetica dei geni del pedaggio. Gli omologhi dei mammiferi sono stati identificati subito dopo l'utilizzo di un ceppo di topo che era ben noto per essere altamente suscettibile alle infezioni da Gram-negativi ed era iporeattivo al lipopolisaccaride (LPS). Si è scoperto che questi topi avevano un cambiamento mutazionale sul gene TLR4, rendendolo non funzionale e questa scoperta ha consolidato l'esistenza e l'importanza delle proteine ​​Toll nei mammiferi. I topi con delezioni genetiche di TLR4 hanno dimostrato l'importanza del TLR per le infezioni batteriche e hanno fornito una chiara evidenza che il TLR4 era specifico per le infezioni Gram-negative. Attualmente sono stati scoperti 10 TLR funzionali nell'uomo e ricerche approfondite hanno identificato una serie di agonisti derivati ​​da agenti patogeni per TLR specifici. È generalmente accettato che la funzione del TLR riconosca le strutture conservate di un organismo o modelli molecolari associati a patogeni (PAMP). Chiaramente questi recettori innati sono fondamentali per sopravvivere a un insulto microbico in quanto forniscono una prima linea di difesa che non dipende dalla generazione di una specifica risposta delle cellule T e B, un processo che può richiedere settimane. Nonostante il loro chiaro ruolo nell'immunità innata, si stanno accumulando prove che la stimolazione dei TLR ha una potente influenza sullo sviluppo dell'immunità mediata dalle cellule T e B attraverso l'attivazione e la maturazione delle cellule dendritiche (DC). Questa conoscenza ha portato allo sviluppo di adiuvanti per vaccini basati su TLR che attivano e fanno maturare le DC.

Panoramica sui monociti e sulle cellule dendritiche Le cellule dendritiche (DC) fanno parte del sistema immunitario innato e adattivo e risiedono nelle interfacce ospite-microbiche, comprese le superfici dell'intestino, del polmone e all'interno della pelle. Queste cellule esaminano costantemente il loro ambiente alla ricerca di patogeni microbici attraverso l'espressione di diverse famiglie di recettori per il riconoscimento di schemi (PRR) inclusi i recettori Toll-like (TLR). Le DC immature sono particolarmente efficienti nell'assorbimento e nell'elaborazione dell'antigene, mentre le DC attivate maturano e diventano potenti cellule che presentano l'antigene ai linfociti T. È importante sottolineare che le DC immature hanno il potenziale per indurre tolleranza immunitaria eliminando le cellule T specifiche dell'antigene, con conseguente assenza di risposta immunitaria. Le DC attivate invece dirigono la risposta immunitaria attraverso il rilascio di particolari citochine. Diversi stimoli iniziali influenzeranno le DC per guidare le cellule T CD4 + a differenziarsi lungo percorsi funzionali molto divergenti tra cui Th1, Th2, Th17 e Treg. Pertanto, la DC è fondamentale per appropriarsi della difesa innata dell'ospite e per orchestrare una risposta adattiva. Dato il loro ruolo fondamentale nella difesa dell'ospite, le DC sono cellule relativamente rare che, allo stato stazionario, si sviluppano indipendentemente dalle altre cellule del sangue. Migliorare e dirigere la funzione e la quantità di DC fornirà benefici sia alle difese dell'ospite che alla scienza dei vaccini. Il laboratorio Steinman ha aperto la strada a un nuovo metodo di vaccinazione prendendo di mira l'antigene di interesse specificamente per la popolazione DC. I vaccini mirati alla DC hanno mostrato risultati promettenti nei modelli animali e un vaccino contro l'HIV mirato alla DC è stato recentemente somministrato per la prima volta agli esseri umani.

I monociti sono un tipo di cellula più abbondante che rappresenta circa il 10% dei leucociti del sangue nell'uomo e il 4% nei topi. I monociti sono cellule effettrici del sangue periferico che partecipano alla difesa dell'ospite e sono efficienti cellule di scavenging. Servono come precursori dei macrofagi tissutali. Nell'uomo, sono stati proposti 3 sottoinsiemi di monociti basati sull'espressione della superficie cellulare di CD14 e CD16, mentre nei topi esistono 2 sottoinsiemi e sono contrassegnati da CD115 e Ly6C. Il ruolo di questi sottoinsiemi durante l'immunità innata richiede ulteriori indagini. Le prove suggeriscono che i monociti possono essere indotti a differenziarsi in DC, tuttavia in precedenza mancavano prove definitive in vivo di ciò. Un recente lavoro nel laboratorio di Steinman ha dimostrato che le DC autentiche in vivo possono essere rapidamente differenziate e mobilitate dal più ampio pool di monociti in periodi di infiammazione acuta e infezione. Questa rapida ridistribuzione potrebbe essere indotta da batteri gram-negativi o LPS ed era interamente dipendente da TLR4. Allo stesso modo, i monociti umani possono essere indotti a differenziarsi in DC, tuttavia la comprensione di questo processo è limitata alla coltura cellulare in vitro con grandi lacune nella nostra comprensione delle DC derivate da monociti umani in vivo. Dati preliminari suggeriscono che la somministrazione di GLA nei topi, come LPS, può mobilitare il pool di monociti per trasformarli in Mo-DC. Non è noto se i monociti umani in vivo espandano rapidamente la popolazione DC dopo la somministrazione di GLA adiuvante TLR4. Comprendere i meccanismi di questa ridistribuzione favorirà la nostra comprensione di come espandere rapidamente e sfruttare l'utilità della DC utilizzando gli adiuvanti. In definitiva, prevediamo che le risposte DC specifiche dell'adiuvante miglioreranno l'immunità delle cellule T e miglioreranno l'efficacia del vaccino.

Razionale per indagare su un adiuvante in isolamento Lo studio adiuvante standard consiste nell'adiuvante in esame combinato con un vaccino autorizzato noto ma non in isolamento. Tuttavia, come descritto in precedenza, speriamo che il GLA possa diventare un importante adiuvante del nostro vaccino contro l'HIV mirato a DC attualmente in fase di sviluppo. La DC rappresenta la cellula presentante l'antigene più potente e il targeting specifico di un antigene di interesse per questa cellula genera risposte immunitarie migliorate. Tuttavia ci sono considerazioni importanti quando si indirizza l'antigene alla DC. Le DC immature non stimolate che incontrano un antigene hanno la capacità di eliminare le cellule T specifiche dell'antigene causando così tolleranza e un solo vaccino antigenico mirato alla DC può causare tolleranza immunitaria. Al contrario, le DC che sono maturate sono in grado di indurre potenti risposte delle cellule T effettrici all'antigene mirato. La DC può essere attivata dalla stimolazione del TLR e quindi la combinazione della maturazione della DC stimolata dal TLR con un antigene mirato alla DC si tradurrebbe in un'immunità mediata da cellule T ottimale. In teoria il vaccino mirato alla DC non potrebbe mai essere somministrato senza un adiuvante per la maturazione della DC e gli effetti e le azioni specifiche del GLA non sarebbero noti se non fosse stato studiato prima in isolamento. Per pianificare un eventuale studio del vaccino contro l'HIV mirato alla DC con un adiuvante, sarà anche fondamentale conoscere gli effetti immunitari temporali del GLA isolato.

Informazioni di base su GLA GLA è una nuova molecola di lipide A (componente attivo dell'LPS naturale) completamente sintetica che combina 6 catene aciliche con un singolo sito di fosforilazione. Il vantaggio di questa molecola LPS-like è che non viene purificata da una fonte batterica consentendo così una soluzione omogenea contenente solo molecole con 6 catene aciliche. Questo è importante perché 6 catene aciliche determinano la massima attivazione del TLR4 mentre le molecole di lipide A con 5 o 7 catene aciliche sono 100 volte meno attive e 4 catene aciliche sono immuno-inibitrici. MPL è un adiuvante del vaccino TLR4 esistente derivato dalla salmonella LPS e rappresenta una miscela eterogenea di 3, 4, 5 e 6 molecole acilate. L'MPL induce un'efficace risposta anticorpale umorale durante la vaccinazione, ma non genera l'immunità delle cellule T CD4, rendendolo un adiuvante indesiderabile per molti vaccini a base di proteine. Nei modelli animali il GLA aggiunto al vaccino Fluzone migliora l'immunità umorale e cellulare all'influenza. GLA è stato testato sugli esseri umani per la sicurezza in combinazione con un vaccino antinfluenzale, tuttavia i suoi effetti individuali non sono stati studiati. In particolare gli effetti isolati su citochine, chemochine e regolazione genica nell'uomo non sono noti e i sottoinsiemi di monociti non sono stati studiati in precedenza.

La formulazione ottimale e la via di somministrazione non sono note; pertanto una componente importante di questa indagine sarà determinare una formulazione e un percorso sicuri e tollerabili. Il GLA è stato somministrato all'uomo in combinazione con il vaccino Fluzone in dosi comprese tra 0,5 μg e 5 μg per via intramuscolare; tuttavia non è stato testato isolatamente ed è stata utilizzata solo l'emulsione stabile olio in acqua (GLA-SE). Fluzone è un vaccino reattogeno e la tossicità dose-limitante si è verificata in 3 dei 4 pazienti che hanno ricevuto Fluzone + GLA-SE ad alte dosi (5μg), ma è stato osservato un buon profilo di sicurezza tra 0,5 e 2,5μg. L'emulsione stabile (SE) contiene squalene ed è stata usata al 2% (vol:vol). Continueremo a utilizzare questa percentuale nella nostra formulazione GLA-SE. Successivamente è stata sviluppata una seconda formulazione di GLA per evitare la necessità di un'emulsione; GLA-AF è acquoso e dovrebbe teoricamente avere un profilo di effetti collaterali ridotto e una minore reattogenicità rispetto a GLA-SE. Ci proponiamo di confrontare le due formulazioni di GLA isolatamente; GLA-SE (emulsione stabile) e GLA-AF (formulazione acquosa). GLA-AF non è mai stato somministrato all'uomo e quindi questa versione rappresenta il primo studio sull'uomo. Per motivi di sicurezza le iniezioni di GLA-AF devono essere separate da un giorno e poiché non sarà possibile sapere chi riceverà GLA-AF, inietteremo i primi nove soggetti in ciascuna coorte a un giorno di distanza. A causa della complessità del numero di gruppi in questo studio, ci iscriveremo e completeremo ogni percorso in sequenza come coorte. La coorte sottocutanea sarà il primo gruppo selezionato, arruolato, randomizzato e iniettato, seguito da intramuscolare.

Sommario Questo studio sarà uno studio clinico di fase 1, randomizzato, controllato con placebo, in doppio cieco per confrontare la formulazione di GLA e la via di somministrazione negli esseri umani. La sicurezza e la tollerabilità delle diverse formulazioni (GLA-SE vs. GLA-AF) e vie (SC, IM, ID) saranno l'obiettivo principale. Il nostro secondo obiettivo sarà quello di dettagliare la risposta immunitaria globale misurando le citochine sistemiche, le chemochine e la regolazione genica globale. Il terzo obiettivo sarà studiare gli effetti del GLA sulle cellule immunitarie del sangue periferico, inclusi i monociti e le cellule dendritiche. Questo studio aggiungerà i primi dati sull'uomo su GLA-AF e descriverà in dettaglio gli effetti isolati di GLA sul sistema immunitario innato. I risultati di questo studio getteranno le basi per un vero studio adiuvante utilizzando l'antigene GLA + e, infine, per utilizzare il GLA come adiuvante del nostro vaccino mirato alla DC negli esseri umani.