Los efectos de GLA en los voluntarios humanos

Las vacunas contra enfermedades infecciosas han sido fundamentales para mejorar la salud humana y siguen siendo un pilar de las estrategias modernas de salud pública. Sin embargo, las infecciones graves que amenazan la vida, como el VIH, la malaria y la tuberculosis, siguen siendo un problema mundial y las enfermedades pandémicas como la influenza continúan amenazando la vida humana. Además, ahora se están buscando vacunas en las áreas de prevención y tratamiento del cáncer. Una barrera fundamental que ha impedido vacunas efectivas para muchas enfermedades es que las vacunas basadas en proteínas convencionales no provocan el requisito crítico de inmunidad mediada por células T. Un enfoque para generar una respuesta mejorada de células T a una vacuna ha sido identificar nuevas proteínas candidatas a diana. Este enfoque no ha resultado en avances significativos en el desarrollo de vacunas. Estamos interesados ​​en un enfoque novedoso que combina estimulantes inmunitarios específicos, o adyuvantes, con un objetivo de vacuna para optimizar y mejorar la respuesta inmunitaria deseada de las células T. El desarrollo y estudio de adyuvantes novedosos como GLA nos permitirá avanzar en nuestra investigación sobre vacunas dirigidas a células dendríticas que conduzcan a vacunas mejoradas para muchas enfermedades diversas.

Antecedentes del receptor tipo Toll (TLR) Los TLR son receptores transmembrana de tipo 1 que comparten un dominio repetido rico en leucina (LRR) en el bucle extracelular y un dominio de homología del receptor Toll/IL-1 (TIR) ​​en la cola intracelular. La importancia de los TLR para la defensa y la inmunidad del huésped se apreció por primera vez en Drosophila, que se volvió susceptible a las infecciones fúngicas luego de la eliminación genética de los genes toll. Los homólogos de mamíferos se identificaron poco después de usar una cepa de ratón que era bien conocida por ser altamente susceptible a las infecciones por Gram-negativos y que no respondía al lipopolisacárido (LPS). Se descubrió que estos ratones tenían un cambio mutacional en el gen TLR4, lo que lo hacía no funcional y este descubrimiento solidificó la existencia y la importancia de las proteínas Toll en los mamíferos. Los ratones con deleciones genéticas de TLR4 demostraron la importancia de TLR para las infecciones bacterianas y proporcionaron una clara evidencia de que TLR4 era específico para las infecciones por Gram negativos. Actualmente se han descubierto 10 TLR funcionales en humanos y una extensa investigación ha identificado varios agonistas derivados de patógenos para TLR específicos. En general, se acepta que los TLR funcionan mediante el reconocimiento de estructuras conservadas de un organismo o patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). Claramente, estos receptores innatos son fundamentales para sobrevivir a un ataque microbiano, ya que proporcionan una primera línea de defensa que no depende de generar una respuesta específica de células T y células B, un proceso que puede llevar semanas. A pesar de su claro papel en la inmunidad innata, se está acumulando evidencia de que la estimulación de TLR tiene una potente influencia en el desarrollo de la inmunidad mediada por células T y B a través de la activación y maduración de las células dendríticas (DC). Este conocimiento ha llevado al desarrollo de adyuvantes de vacunas basados ​​en TLR que activan y maduran DC.

Descripción general de monocitos y células dendríticas Las células dendríticas (CD) son parte de los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos y residen en las interfaces huésped-microbios, incluidas las superficies del intestino, los pulmones y dentro de la piel. Estas células examinan constantemente su entorno en busca de patógenos microbianos a través de la expresión de varias familias de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), incluidos los receptores tipo Toll (TLR). Las DC inmaduras son particularmente eficientes en la captación y el procesamiento de antígenos, mientras que las DC activadas maduran y se convierten en potentes células presentadoras de antígenos para los linfocitos T. Es importante destacar que las DC inmaduras tienen el potencial de inducir tolerancia inmunitaria mediante la eliminación de células T específicas de antígeno, lo que da como resultado que no haya una respuesta inmunitaria. Sin embargo, las DC activadas dirigen la respuesta inmune a través de la liberación de citoquinas particulares. Diferentes estímulos iniciales influirán en DC para impulsar a las células T CD4+ a diferenciarse a lo largo de vías funcionales muy divergentes, incluidas Th1, Th2, Th17 y Treg. Por lo tanto, las DC son fundamentales para la defensa innata adecuada del huésped, así como para orquestar una respuesta adaptativa. Dado su papel fundamental en la defensa del huésped, las CD son células relativamente raras que, en estado estable, se desarrollan independientemente de otras células sanguíneas. Mejorar y dirigir la función y la cantidad de DC beneficiará tanto a las defensas del huésped como a la ciencia de las vacunas. El laboratorio de Steinman ha sido pionero en un nuevo método de vacunación al dirigirse al antígeno de interés específicamente para la población de DC. Las vacunas dirigidas contra DC se han mostrado promisorias en modelos animales y recientemente se administró por primera vez a humanos una vacuna contra el VIH dirigida contra DC.

Los monocitos son un tipo de célula más abundante que representa aproximadamente el 10 % de los leucocitos sanguíneos en humanos y el 4 % en ratones. Los monocitos son células efectoras de sangre periférica que participan en la defensa del huésped y son células depuradoras eficientes. Sirven como precursores de los macrófagos tisulares. En humanos, se han propuesto 3 subconjuntos de monocitos basados ​​en la expresión de CD14 y CD16 en la superficie celular, mientras que en ratones existen 2 subconjuntos y están marcados por CD115 y Ly6C. El papel de estos subconjuntos durante la inmunidad innata requiere más investigación. La evidencia sugiere que se puede inducir a los monocitos para que se diferencien en DC, sin embargo, anteriormente faltaba evidencia in vivo definitiva de esto. Un trabajo reciente en el laboratorio de Steinman ha demostrado que las CD auténticas in vivo se pueden diferenciar y movilizar rápidamente del grupo más grande de monocitos en momentos de inflamación e infección agudas. Este redespliegue rápido podría ser inducido por bacterias gramnegativas o LPS y dependía completamente de TLR4. De manera similar, los monocitos humanos pueden inducirse a diferenciarse en DC, sin embargo, la comprensión de este proceso se limita al cultivo celular in vitro con grandes lagunas en nuestra comprensión de las DC derivadas de monocitos humanos in vivo. Los datos preliminares sugieren que la administración de GLA en ratones, como LPS, puede movilizar la reserva de monocitos para que se convierta en Mo-DC. Se desconoce si los monocitos humanos in vivo expanden rápidamente la población de DC después de la administración del adyuvante GLA de TLR4. Comprender los mecanismos de esta redistribución mejorará nuestra comprensión de cómo expandir y aprovechar rápidamente la utilidad de DC usando adyuvantes. En última instancia, anticipamos que las respuestas de DC específicas del adyuvante mejorarán la inmunidad de las células T y mejorarán la eficacia de la vacuna.

Justificación para investigar un adyuvante aislado El ensayo adyuvante estándar consiste en el adyuvante bajo investigación combinado con una vacuna autorizada conocida, pero no de forma aislada. Sin embargo, como se describió anteriormente, tenemos la esperanza de que GLA pueda convertirse en un adyuvante importante de nuestra vacuna contra el VIH dirigida a DC actualmente en desarrollo. La DC representa la célula presentadora de antígenos más potente y, al dirigirse específicamente a un antígeno de interés para esta célula, se generan respuestas inmunitarias mejoradas. Sin embargo, existen consideraciones importantes cuando se dirige el antígeno a DC. Las DC inmaduras no estimuladas que se encuentran con un antígeno tienen la capacidad de eliminar las células T específicas del antígeno, lo que provoca tolerancia y una vacuna de antígeno dirigida a DC por sí sola puede provocar tolerancia inmunitaria. En contraste, las DC que han madurado son capaces de inducir potentes respuestas de células T efectoras al antígeno objetivo. Las DC pueden activarse mediante la estimulación de TLR y, por lo tanto, la combinación de la maduración de DC estimulada por TLR con un antígeno dirigido a DC daría como resultado una inmunidad mediada por células T óptima. En teoría, la vacuna dirigida a DC nunca podría administrarse sin un adyuvante de maduración de DC y los efectos y acciones específicos de GLA no se conocerían a menos que se estudiara primero de forma aislada. Para planificar un eventual ensayo de vacuna contra el VIH dirigido a DC con un adyuvante, también será fundamental conocer los efectos inmunitarios temporales del GLA aislado.

Información de antecedentes de GLA GLA es una nueva molécula de lípido A (componente activo de LPS natural) completamente sintética que combina 6 cadenas de acilo con un solo sitio de fosforilación. La ventaja de esta molécula similar a LPS es que no se purifica a partir de una fuente bacteriana, lo que permite una solución homogénea que solo contiene moléculas con 6 cadenas de acilo. Esto es importante porque 6 cadenas de acilo dan como resultado la máxima activación de TLR4, mientras que las moléculas de lípido A con 5 o 7 cadenas de acilo son 100 veces menos activas y 4 cadenas de acilo son inmunoinhibidoras. MPL es un adyuvante de vacuna TLR4 existente que se deriva de salmonella LPS y representa una mezcla heterogénea de 3, 4, 5 y 6 moléculas aciladas. La MPL induce una respuesta de anticuerpos humorales eficaz durante la vacunación, pero no genera inmunidad de células T CD4, lo que la convierte en un adyuvante indeseable para muchas vacunas basadas en proteínas. En modelos animales, el GLA añadido a la vacuna Fluzone mejora la inmunidad humoral y celular frente a la gripe. Se ha probado la seguridad de GLA en humanos en combinación con una vacuna contra la influenza; sin embargo, no se han estudiado sus efectos individuales. En particular, los efectos aislados sobre la regulación de citoquinas, quimioquinas y genes en humanos no se conocen y los subconjuntos de monocitos no se investigaron previamente.

No se conocen la formulación y la vía de administración óptimas; por lo tanto, un componente principal de esta investigación será determinar una fórmula y una ruta seguras y tolerables. El GLA se ha administrado a humanos en combinación con la vacuna Fluzone en dosis de 0,5 μg a 5 μg por vía intramuscular; sin embargo, no se ha probado de forma aislada y solo se utilizó la emulsión estable de aceite en agua (GLA-SE). Fluzone es una vacuna reactogénica y se produjo toxicidad limitante de la dosis en 3 de 4 pacientes que recibieron Fluzone + dosis altas de GLA-SE (5 μg), pero se observó un buen perfil de seguridad entre 0,5 y 2,5 μg. La emulsión estable (SE) contiene escualeno y se usó al 2% (vol:vol). Continuaremos usando este porcentaje en nuestra formulación GLA-SE. Posteriormente se ha desarrollado una segunda formulación de GLA para evitar la necesidad de una emulsión; GLA-AF es acuoso y teóricamente debería tener un perfil de efectos secundarios reducido y menos reactogenicidad que GLA-SE. Planeamos comparar las dos formulaciones de GLA de forma aislada; GLA-SE (emulsión estable) y GLA-AF (formulación acuosa). GLA-AF nunca se ha administrado a humanos y, por lo tanto, esta versión representa el primer ensayo en humanos. Por razones de seguridad, las inyecciones de GLA-AF deben estar separadas por un día y dado que no será posible saber quién recibirá GLA-AF, inyectaremos a los primeros nueve sujetos de cada cohorte con un día de diferencia. Debido a la complejidad de la cantidad de grupos en este estudio, inscribiremos y completaremos cada ruta secuencialmente como una cohorte. La cohorte subcutánea será el primer grupo examinado, inscrito, aleatorizado e inyectado, seguido de intramuscular.

Resumen Este estudio será un ensayo clínico de fase 1, aleatorizado, controlado con placebo y doble ciego para comparar la formulación y la vía de administración de GLA en humanos. La seguridad y la tolerabilidad de las diferentes formulaciones (GLA-SE frente a GLA-AF) y rutas (SC, IM, ID) serán el enfoque principal. Nuestro segundo enfoque será detallar la respuesta inmune global midiendo las citocinas sistémicas, las quimiocinas y la regulación genética global. El tercer enfoque será investigar los efectos de GLA en las células inmunitarias de la sangre periférica, incluidos los monocitos y las células dendríticas. Este estudio agregará los primeros datos en humanos sobre GLA-AF y detallará los efectos aislados de GLA en el sistema inmunitario innato. Los resultados de este ensayo sentarán las bases para un verdadero ensayo adyuvante que use el antígeno GLA+ y, en última instancia, para usar GLA como adyuvante de nuestra vacuna dirigida a DC en humanos.