Die Auswirkungen von GLA auf menschliche Freiwillige

Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten haben maßgeblich zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit beigetragen und bleiben eine Säule moderner Strategien für die öffentliche Gesundheit. Doch ernsthafte lebensbedrohliche Infektionen wie HIV, Malaria und Tuberkulose bleiben ein globales Problem, und pandemische Krankheiten wie die Influenza bedrohen weiterhin das menschliche Leben. Außerdem werden Impfstoffe jetzt in den Bereichen der Krebsprävention und -behandlung verfolgt. Ein grundlegendes Hindernis, das wirksame Impfstoffe für viele Krankheiten verhindert hat, besteht darin, dass herkömmliche, auf Proteinen basierende Impfstoffe nicht die kritische Anforderung einer T-Zell-vermittelten Immunität hervorrufen. Ein Ansatz zur Erzeugung einer verbesserten T-Zell-Antwort auf einen Impfstoff bestand darin, neue Zielproteinkandidaten zu identifizieren. Dieser Ansatz hat nicht zu wesentlichen Fortschritten in der Impfstoffentwicklung geführt. Wir sind an einem neuartigen Ansatz interessiert, der spezifische Immunstimulanzien oder Adjuvantien mit einem Impfstoffziel kombiniert, um die gewünschte T-Zell-Immunantwort zu optimieren und zu verstärken. Die Entwicklung und Untersuchung neuartiger Adjuvantien wie GLA wird es uns ermöglichen, unsere Erforschung von auf dendritische Zellen ausgerichteten Impfstoffen voranzutreiben, was zu verbesserten Impfstoffen für viele verschiedene Krankheiten führen wird.

Hintergrund des Toll-Like-Rezeptors (TLR) Die TLRs sind Typ-1-Transmembranrezeptoren, die eine leucinreiche Wiederholungsdomäne (LRR) in der extrazellulären Schleife und eine Homologiedomäne des Toll/IL-1-Rezeptors (TIR) ​​im intrazellulären Schwanz teilen. Die Bedeutung von TLRs für die Abwehr und Immunität des Wirts wurde erstmals bei Drosophila erkannt, die nach genetischer Deletion der Toll-Gene anfällig für Pilzinfektionen wurde. Homologe von Säugetieren wurden kurz nach der Verwendung eines Mausstamms identifiziert, der bekanntermaßen sehr anfällig für gramnegative Infektionen war und auf Lipopolysaccharid (LPS) schwach ansprach. Es wurde festgestellt, dass diese Mäuse eine Mutationsänderung am TLR4-Gen aufweisen, wodurch es funktionsunfähig wird, und diese Entdeckung festigte die Existenz und Bedeutung der Toll-Proteine ​​bei Säugetieren. Mäuse mit genetischen Deletionen von TLR4 zeigten die Bedeutung von TLR für bakterielle Infektionen und lieferten klare Beweise dafür, dass TLR4 spezifisch für gramnegative Infektionen war. Derzeit wurden 10 funktionelle TLRs beim Menschen entdeckt, und umfangreiche Forschungen haben eine Reihe von pathogenabgeleiteten Agonisten für spezifische TLRs identifiziert. Es ist allgemein anerkannt, dass die Funktion des TLR durch Erkennen konservierter Strukturen eines Organismus oder von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs) erfolgt. Diese angeborenen Rezeptoren sind eindeutig entscheidend für das Überleben eines mikrobiellen Angriffs, da sie eine erste Verteidigungslinie darstellen, die nicht von der Erzeugung einer spezifischen T-Zell- und B-Zell-Antwort abhängig ist, ein Prozess, der Wochen dauern kann. Trotz ihrer klaren Rolle bei der angeborenen Immunität häufen sich die Beweise dafür, dass die TLR-Stimulation durch die Aktivierung und Reifung dendritischer Zellen (DC) einen starken Einfluss auf die Entwicklung der T- und B-Zell-vermittelten Immunität hat. Dieses Wissen hat zur Entwicklung von TLR-basierten Impfstoffadjuvantien geführt, die DC aktivieren und reifen lassen.

Überblick über Monozyten und dendritische Zellen Dendritische Zellen (DC) sind Teil des angeborenen und adaptiven Immunsystems und befinden sich an den Grenzflächen zwischen Wirt und Mikroben, einschließlich der Oberflächen des Darms, der Lunge und innerhalb der Haut. Diese Zellen untersuchen ständig ihre Umgebung auf der Suche nach mikrobiellen Krankheitserregern durch die Expression mehrerer Familien von Mustererkennungsrezeptoren (PRR), einschließlich der Toll-like-Rezeptoren (TLR). Unreife DC sind besonders effizient bei der Antigenaufnahme und -prozessierung, während aktivierte DC reifen und zu potenten Antigen-präsentierenden Zellen für T-Lymphozyten werden. Wichtig ist, dass unreife DC das Potenzial haben, eine Immuntoleranz zu induzieren, indem sie Antigen-spezifische T-Zellen löschen, was zu keiner Immunantwort führt. Aktivierte DC steuern jedoch die Immunantwort durch die Freisetzung bestimmter Zytokine. Unterschiedliche anfängliche Stimuli werden DC beeinflussen, um CD4+ T-Zellen dazu zu bringen, sich entlang sehr unterschiedlicher funktioneller Pfade zu differenzieren, einschließlich Th1, Th2, Th17 und Treg. Daher sind DC entscheidend für eine angemessene angeborene Wirtsverteidigung sowie für die Orchestrierung einer adaptiven Reaktion. Angesichts ihrer zentralen Rolle bei der Wirtsabwehr sind DC relativ seltene Zellen, die sich im Steady State unabhängig von anderen Blutzellen entwickeln. Die Verbesserung und Lenkung der Funktion und Menge von DC wird sowohl der Wirtsabwehr als auch der Impfstoffwissenschaft zugute kommen. Das Steinman-Labor hat Pionierarbeit für eine neuartige Impfmethode geleistet, indem das interessierende Antigen spezifisch auf die DC-Population gerichtet wird. DC-gerichtete Impfstoffe haben sich in Tiermodellen als vielversprechend erwiesen, und kürzlich wurde erstmals ein DC-gerichteter HIV-Impfstoff an Menschen verabreicht.

Monozyten sind ein häufiger vorkommender Zelltyp, der etwa 10 % der Blutleukozyten beim Menschen und 4 % bei Mäusen ausmacht. Monozyten sind periphere Bluteffektorzellen, die an der Abwehr des Wirts beteiligt sind und effiziente Aasfresserzellen sind. Sie dienen als Vorläufer für Gewebemakrophagen. Beim Menschen wurden 3 Untergruppen von Monozyten basierend auf der Zelloberflächenexpression von CD14 und CD16 vorgeschlagen, während 2 Untergruppen bei Mäusen existieren und durch CD115 und Ly6C markiert sind. Die Rolle dieser Untergruppen während der angeborenen Immunität erfordert weitere Untersuchungen. Es gibt Hinweise darauf, dass Monozyten dazu gebracht werden können, sich in DC zu differenzieren, jedoch fehlte zuvor ein endgültiger in vivo-Beweis dafür. Jüngste Arbeiten im Steinman-Labor haben gezeigt, dass authentische DC in vivo in Zeiten akuter Entzündungen und Infektionen schnell aus dem größeren Monozytenpool differenziert und mobilisiert werden können. Diese schnelle Umschichtung konnte entweder durch gramnegative Bakterien oder LPS induziert werden und war vollständig von TLR4 abhängig. In ähnlicher Weise können menschliche Monozyten zur Differenzierung in DC induziert werden, jedoch ist das Verständnis dieses Prozesses auf die In-vitro-Zellkultur beschränkt, wobei unser Verständnis von in vivo von menschlichen Monozyten abgeleiteten DC große Lücken aufweist. Vorläufige Daten deuten darauf hin, dass die GLA-Verabreichung bei Mäusen, wie LPS, den Monozyten-Pool mobilisieren kann, um Mo-DC zu werden. Es ist nicht bekannt, ob menschliche Monozyten in vivo die DC-Population nach Verabreichung von TLR4-Adjuvans-GLA schnell erweitern. Das Verständnis der Mechanismen dieser Umverteilung wird unser Verständnis darüber erweitern, wie der Nutzen von DC mithilfe von Adjuvantien schnell erweitert und nutzbar gemacht werden kann. Letztendlich gehen wir davon aus, dass Adjuvans-spezifische DC-Antworten die T-Zell-Immunität verbessern und die Wirksamkeit des Impfstoffs steigern werden.

Begründung für die isolierte Untersuchung eines Adjuvans Die standardmäßige Adjuvans-Studie besteht aus dem untersuchten Adjuvans in Kombination mit einem bekannten zugelassenen Impfstoff, jedoch nicht isoliert. Wie bereits beschrieben, hoffen wir jedoch, dass GLA ein wichtiges Adjuvans unseres DC-gerichteten HIV-Impfstoffs werden kann, der sich derzeit in der Entwicklung befindet. Die DC stellt die stärkste antigenpräsentierende Zelle dar, und das spezifische Targeting eines interessierenden Antigens auf diese Zelle erzeugt verbesserte Immunantworten. Es gibt jedoch wichtige Überlegungen, wenn Antigen auf DC gerichtet werden soll. Unreife unstimulierte DC, die auf ein Antigen treffen, haben die Fähigkeit, Antigen-spezifische T-Zellen zu löschen, wodurch eine Toleranz verursacht wird, und ein DC-gerichteter Antigen-Impfstoff allein kann eine Immuntoleranz verursachen. Im Gegensatz dazu sind DC, die gereift sind, in der Lage, starke Effektor-T-Zellantworten auf das Zielantigen zu induzieren. DC können durch TLR-Stimulation aktiviert werden, und daher würde die Kombination einer TLR-stimulierten DC-Reifung mit einem DC-gerichteten Antigen zu einer optimalen T-Zell-vermittelten Immunität führen. Theoretisch könnte der DC-gerichtete Impfstoff niemals ohne ein DC-Reifungsadjuvans verabreicht werden, und die spezifischen Wirkungen und Wirkungen von GLA wären nicht bekannt, es sei denn, es würde zuerst isoliert untersucht. Um eine eventuelle DC-gerichtete HIV-Impfstoffstudie mit einem Adjuvans zu planen, wird es auch entscheidend sein, die zeitlichen Immuneffekte von isoliertem GLA zu kennen.

Hintergrundinformationen zu GLA GLA ist ein neues, vollständig synthetisches Lipid-A-Molekül (aktiver Bestandteil von natürlichem LPS), das 6 Acylketten mit einer einzigen Phosphorylierungsstelle kombiniert. Der Vorteil dieses LPS-ähnlichen Moleküls besteht darin, dass es nicht aus einer bakteriellen Quelle gereinigt wird, wodurch eine homogene Lösung ermöglicht wird, die nur Moleküle mit 6 Acylketten enthält. Dies ist wichtig, da 6 Acylketten zu einer maximalen TLR4-Aktivierung führen, während Lipid-A-Moleküle mit 5 oder 7 Acylketten 100-mal weniger aktiv sind und 4 Acylketten immunhemmend sind. MPL ist ein bestehender TLR4-Impfstoff-Adjuvans, der von Salmonellen-LPS abgeleitet ist und eine heterogene Mischung aus 3, 4, 5 und 6 acylierten Molekülen darstellt. MPL induziert während der Impfung eine wirksame humorale Antikörperantwort, erzeugt jedoch keine CD4-T-Zell-Immunität, was es zu einem unerwünschten Adjuvans für viele proteinbasierte Impfstoffe macht. In Tiermodellen verbessert dem Fluzone-Impfstoff zugesetztes GLA die humorale und zelluläre Immunität gegen Influenza. GLA wurde am Menschen auf Sicherheit in Kombination mit einem Influenza-Impfstoff getestet, seine individuellen Wirkungen wurden jedoch nicht untersucht. Insbesondere die isolierten Wirkungen auf Zytokin, Chemokin und Genregulation beim Menschen sind nicht bekannt und Monozyten-Untergruppen wurden bisher nicht untersucht.

Die optimale Formulierung und der Verabreichungsweg sind nicht bekannt; Daher wird eine Hauptkomponente dieser Untersuchung darin bestehen, eine sichere und tolerierbare Formulierung und Route zu bestimmen. GLA wurde Menschen in Kombination mit dem Fluzone-Impfstoff in Dosen von 0,5 μg bis 5 μg intramuskulär verabreicht; es wurde jedoch nicht isoliert getestet, und es wurde nur die Öl-in-Wasser-stabile Emulsion (GLA-SE) verwendet. Fluzone ist ein reaktogener Impfstoff, und bei 3 von 4 Patienten, die Fluzone + hochdosiertes GLA-SE (5 μg) erhielten, trat eine dosislimitierende Toxizität auf, aber zwischen 0,5 und 2,5 μg wurde ein gutes Sicherheitsprofil beobachtet. Die stabile Emulsion (SE) enthält Squalen und wurde mit 2 % (Vol:Vol) verwendet. Wir werden diesen Prozentsatz weiterhin in unserer GLA-SE-Formulierung verwenden. Anschließend wurde eine zweite Formulierung von GLA entwickelt, um die Notwendigkeit einer Emulsion zu vermeiden; GLA-AF ist wässrig und sollte theoretisch ein reduziertes Nebenwirkungsprofil und eine geringere Reaktogenität als GLA-SE aufweisen. Wir planen, die beiden Formulierungen von GLA isoliert zu vergleichen; GLA-SE (stabile Emulsion) und GLA-AF (wässrige Formulierung). GLA-AF wurde noch nie an Menschen verabreicht und daher stellt diese Version eine erste Studie am Menschen dar. Aus Sicherheitsgründen müssen GLA-AF-Injektionen durch einen Tag getrennt werden, und da nicht bekannt sein wird, wer GLA-AF erhalten wird, werden wir die ersten neun Probanden in jeder Kohorte im Abstand von einem Tag injizieren. Aufgrund der Komplexität der Anzahl der Gruppen in dieser Studie werden wir jede Route nacheinander als Kohorte einschreiben und absolvieren. Die subkutane Kohorte wird die erste Gruppe sein, die gescreent, aufgenommen, randomisiert und injiziert wird, gefolgt von intramuskulären.

Zusammenfassung Bei dieser Studie handelt es sich um eine randomisierte, placebokontrollierte, doppelblinde klinische Phase-1-Studie zum Vergleich der GLA-Formulierung und des Verabreichungswegs beim Menschen. Sicherheit und Verträglichkeit der verschiedenen Formulierungen (GLA-SE vs. GLA-AF) und Verabreichungswege (SC, IM, ID) werden im Vordergrund stehen. Unser zweiter Schwerpunkt wird darin bestehen, die globale Immunantwort detailliert zu beschreiben, indem wir systemische Zytokine, Chemokine und die globale Genregulation messen. Der dritte Schwerpunkt liegt auf der Untersuchung der Wirkungen von GLA auf die peripheren Blutimmunzellen, einschließlich Monozyten und dendritische Zellen. Diese Studie wird erstmals am Menschen Daten zu GLA-AF hinzufügen und die isolierten Wirkungen von GLA auf das angeborene Immunsystem detailliert beschreiben. Die Ergebnisse dieser Studie werden die Grundlage für eine echte adjuvante Studie mit GLA + -Antigen und letztendlich für die Verwendung von GLA als Adjuvans für unseren DC-gerichteten Impfstoff beim Menschen legen.