血液透析患者自噬相关蛋白与炎症标志物的相关性

研究设计和人口

研究设计我们将招募30名健康志愿者作为对照组。 180 名性别和年龄匹配的血液透析患者将被纳入这项研究。 要纳入研究，患者必须年满 20 岁，并且接受门诊血液透析 (HD) 治疗至少 3 个月。 如果患者患有恶性肿瘤、严重肝病（胆红素 >1.6 mg/dl）、未控制的高血压、严重肥胖症（BMI >35），目前正在服用卡马西平、他汀类药物或免疫抑制剂，则他们被排除在外。 研究中的合作医师对每个受试者的病历进行了彻底审查。 所有受试者都将提供参与的书面知情同意书，并且协议将发送给东氏台中港湾医院的机构审查委员会

研究参数 透析前血液样本在工作日的中旬获取。 取样后 30 分钟内，将剩余的血液以 3,000 g 离心 10 分钟，立即等分并冷冻在 -80°C 直至进一步分析。

细胞因子测定 以下炎症和止血标志物通过 ELISA 在患者血清中测定：白细胞介素 6（Quantikine，R&D Systems）和高灵敏度测定（hsCRP）中的 CRP 血浆浓度。

脂类/脂蛋白分析 总胆固醇、高密度脂蛋白 (HDL) 胆固醇和甘油三酯浓度通过酶法测定。 血浆葡萄糖通过葡萄糖氧化酶法测量。

脂糖结合蛋白 (LBP) 的测量 使用标准化酶联免疫吸附测定 (ELISA) 方法从血清样本和对照中测定 LBP，并将来自正常对照受试者的血清用于测定间变异。

PBMC 的分离 乙二胺四乙酸 Vacutainer™ 管用于在清晨从禁食的参与者中收集静脉血样 (10 ml)。 通过在 800 x g 和 25˚C 下离心 15 分钟收集上清液的等分试样，然后储存在 -80˚C 下。 将剩余的血液混合并缓慢滴加到装有 10 ml Ficoll 分离介质的离心管中。 PBMC 根据制造商的协议进行隔离，并储存在 -80˚C。

Western blotting PBMCs 用 RIPA 裂解缓冲液裂解，并根据制造商的协议用 BCA 蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。 随后，使用 12% SDS-PAGE 分离 20 μg 蛋白质/孔。 随后将蛋白质在 300 mA 下转移到硝酸纤维素膜上 60 分钟。 硝酸纤维素膜用含有 0.1% 吐温 20 (TBST) 和 5% 脱脂奶粉的 Tris 缓冲盐水在室温下封闭 2 小时。 硝酸纤维素膜与一抗在 4˚C 下在摇床上以低速孵育过夜。 硝酸纤维素膜用 TBST 洗涤 3 次，二抗室温孵育 1 h。 洗涤三次后，将ECL底物加入到硝酸纤维素膜中。 使用 Image Lab™ 软件检测信号，并使用成像软件量化条带密度。

将购买针对微管相关蛋白 1A/1B 轻链 3A、泛素结合蛋白 p62 和 beclin-1 以及 GAPDH 的一抗。 使用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗。