Korrelation zwischen Autophagie-bezogenen Proteinen und Entzündungsmarkern bei Hämodialysepatienten

Studiendesign und Population

Studiendesign Wir nehmen 30 gesunde Freiwillige als Kontrollgruppe auf. 180 geschlechts- und altersangepasste Hämodialysepatienten werden in diese Studie aufgenommen. Um in die Studie aufgenommen zu werden, müssen die Patienten mindestens 20 Jahre alt sein und sich seit mindestens 3 Monaten in ambulanter Hämodialyse (HD) befinden. Patienten sind ausgeschlossen, wenn sie einen bösartigen Tumor, eine schwere Lebererkrankung (Bilirubin > 1,6 mg/dl), unkontrollierten Bluthochdruck, schwere Fettleibigkeit (BMI > 35) hatten und derzeit Carbamazepin, Statine oder Immunsuppressiva einnehmen. Die Krankenakte wird für jeden Probanden von einem an der Studie beteiligten Arzt gründlich überprüft. Alle Probanden geben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme ab, und das Protokoll wird an die institutionellen Prüfungsausschüsse des Taichung Metroharbour Hospital von Tungs gesendet

Studienparameter Prädialyse-Blutproben werden an einem Tag in der Mitte der Woche entnommen. Innerhalb von 30 min nach der Entnahme wird das verbleibende Blut bei 3.000 g für 10 min zentrifugiert, sofort aliquotiert und bis zur weiteren Analyse bei -80 °C eingefroren.

Zytokin-Assays Die folgenden Entzündungs- und Blutstillungsmarker werden durch ELISA in Patientenseren bestimmt: Interleukin-6 (Quantikine, R&D Systems) und Plasmakonzentrationen von CRP in einem hochsensitiven Assay (hsCRP).

Analyse von Lipiden/Lipoproteinen Gesamtcholesterin, HDL-Cholesterin (High Density Lipoprotein) und Triglyceridkonzentrationen werden enzymatisch bestimmt. Plasmaglukose wird durch ein Glukose-Oxidase-Verfahren gemessen.

Messungen des Liposaccharid-bindenden Proteins (LBP) Das LBP wurde aus Serumproben und Kontrollen unter Verwendung von standardisierten ELISA-Verfahren (Enzymelinked Immunosorbent Assay) bestimmt, und Serum von normalen Kontrollsubjekten wurde für die Variation zwischen den Assays verwendet.

Isolierung von PBMCs Ethylendiamintetraessigsäure Vacutainer™-Röhrchen werden verwendet, um venöse Blutproben (10 ml) von nüchternen Teilnehmern am frühen Morgen zu entnehmen. Aliquots des Überstands werden durch 15-minütige Zentrifugation bei 800 x g und 25 °C gesammelt und anschließend bei -80 °C gelagert. Das restliche Blut wird gemischt und langsam tropfenweise in ein Zentrifugenröhrchen gegeben, das 10 ml Ficoll-Trennmedium enthält. PBMCs werden gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert und bei -80 °C gelagert.

Western-Blot-PBMCs werden mit RIPA-Lysepuffer lysiert und die Proteinkonzentrationen mit dem BCA-Protein-Assay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers bestimmt. Anschließend werden 20 µg Protein/Well mittels 12 % SDS-PAGE aufgetrennt. Anschließend werden die Proteine ​​bei 300 mA für 60 min auf Nitrozellulosemembranen transferiert. Die Nitrozellulosemembranen werden mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 % Tween 20 (TBST) und 5 % fettfreies Milchpulver enthält, für 2 h bei Raumtemperatur blockiert. Die Nitrozellulosemembranen werden mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler mit langsamer Geschwindigkeit inkubiert. Die Nitrozellulosemembranen werden dreimal mit TBST gewaschen und mit sekundären Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wird ECL-Substrat zu der Nitrozellulosemembran gegeben. Das Signal wird mit der Image Lab™-Software erkannt und die Bandendichte wird mit der Imager-Software quantifiziert .

Die primären Antikörper gegen Mikrotubuli-assoziierte Proteine ​​1A/1B leichte Kette 3A , Ubiquitin-bindendes Protein p62 und Beclin-1 sowie GAPDH werden erworben. Peroxidase-konjugierte Ziegen-anti-Maus- und Ziegen-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper werden verwendet.